重组金丝雀痘病毒载体疫苗研制进展

李文桂， 陈雅棠

重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所，重庆400016

金丝雀痘病毒（canarypox virus，CNPV）感染是造成雀痘的主要病因，可通过接种CNPV 的减毒株ALVAC 进行免疫。目的基因常见转移载体为pALVAC，一般含有病毒的左右边界序列（R/L）、合成的牛痘病毒早期/晚期启动子（pEL）、多克隆位点（MCS）、受牛痘病毒H6基因启动子调节的LacZ基因（H6-LacZ）或受牛痘病毒 H6 基因启动子调节的uidA基因（H6-uidA）[1]。ALVAC 的基因组含有大量的复制非必需区，将大于30 kb的外源基因插入该区并不影响该病毒的感染性，因此，可改造为疫苗载体，且ALVAC减毒株仅在禽类细胞中复制，在哺乳动物细胞中并不复制，但能表达外源基因，诱导保护性的免疫应答[2]。将目的基因插入转移载体，构建重组质粒，再将重组质粒与ALVAC 的基因组进行基因交换，从而获得重组病毒，通过筛选培养、分离纯化即可用于免疫接种。

已有研究构建了大量CNPV 载体介导的病原体疫苗，通过肌肉注射、皮下注射或腹腔注射等途径接种小鼠、猩猩、狒狒、猿猴或健康志愿者后均可诱导细胞或体液免疫应答（表1）。目前以CNPV 为载体的病原体疫苗包括：马流感病毒（equine influenza virus，EIV）、犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）、麻疹病毒（measles virus，MV）、尼帕病毒（Nipah virus，NiV）、艾滋病毒（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）、非洲马病病毒4 型（African horse sickness virus type 4，AHSV-4）、蓝舌病毒17 型（bluetongue virus serotype 17，BTV-17）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、巨细胞病毒（cytomelovirus，CMV）、狂犬病毒（rabies virus）和婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）等。本文概述了CNPV 载体介导的病原体疫苗的构建及其保护性免疫机制等方面的研制现状，旨在为病毒和寄生虫病的免疫预防提供参考。

表1 重组CNPV疫苗诱导的抗病毒和寄生虫免疫应答特征Table 1 Characteristic of immune response induced by recombinant CNPV-vectered vaccines against viruses and parasite

1 已成功构建的重组CNPV病毒

1.1 正粘病毒

1.1.1 马流感病毒 马流感病毒感染可导致马呼吸道感染，注射重组血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白的儿马可对抗H3N8 株，提示HA 是一种候选分子。为研制重组CNPV、提取EIV 的总RNA 作为模板扩增HA基因，插入pALVAC 得到pALVAC-HA，将其转染鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast，CEF），并进行筛选和培养，Western blot 方法显示患者血清可结合重组病毒表达的60 kD 的HA 蛋白。同时通过肌肉注射将105.6半数组织细胞感染量（50% tissue cell infective dose，TCID50）重组病毒免疫Welsh 矮种马，初次注射后5周重复1次，在初次注射后7周血清的中和抗体明显升高，此时采用肌肉注射的方法将107.6半数鸡胚感染量（50% egg infectious dose，EID50）马流感病毒A 株进行攻击，在攻击后2 周发现接种组鼻咽拭子的病毒负荷明显降低。此外，rCNPV-HA 疫苗接种于儿马或狗中均可产生中和抗体，并可对抗马流感病毒有毒株的攻击[3-6]。

1.1.2 禽流感病毒 禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是爆发禽流感的主要病因。HA 蛋白是病毒表面的主要抗原，HA 的核酸疫苗免疫宿主可诱导中和性抗体的出现。2010 年，有研究者[7]将 107.2CCID50的 rCNPV-HA 疫苗皮下注射幼猫，并在第一次注射后3 周加强1 次，第1 次注射后10 周发现血清的中和抗体提升，此时通过雾化吸入将105CCID50的H5N1 株进行感染攻击，在攻击后2 周提示接种组鼻咽拭子和肺组织的病毒负荷明显降低。

1.2 副粘病毒

1.2.1 犬瘟热病毒 犬瘟热病毒感染可导致犬瘟热。研究发现重组糖蛋白H 在病毒的融合、生长和细胞嗜性等方面发挥作用。为验证rCNPV-H疫苗的免疫效率，首先将106.8TCID50的rCNPV-H疫苗分别皮下注射狐狸（Vulpes zerda）和笔尾獴（Suricata suricatta），在第 1 次注射后 3 周加强 1次，结果显示，血清IgG 在第1 次注射后6 周达到较高水平。有研究者将rCNPV-H 疫苗接种大熊猫（Ailuropoda melanoleuca），也得到类似的结果[8-9]。

1.2.2 麻疹病毒 麻疹病毒感染是麻疹的主要病因，将含有HA 和融合蛋白（fusion protein，F）的DNA 疫苗接种于小鼠可产生高滴度的中和抗体。1992 年，有研究者[10]将麻疹病毒的F/HA基因片断插入pUC19 的多克隆位点构建重组质粒pUC19-F/HA，并与pSPMF75 重组得到pSPMF-F/HA，转染CEF细胞株，筛选重组病毒，Western blot提示患者血清结合rCNPV-F/HA 中的F抗原和HA抗原。保护力试验表明，将1×108噬菌斑形成单位（plaque forming unit，PFU）的rCNPV-F/HA 皮下注射毕格犬，注射后5 周血清中的中和抗体明显升高，此时用104TCID50犬瘟热病毒的SH 株进行攻击，在攻击后10 d 发现血清中的病毒负荷有一定程度的降低。

1.2.3 尼帕病毒 尼帕病毒感染可引起尼帕病毒性脑炎，研究发现其基因组中的F基因编码融合蛋白，该蛋白可与糖蛋白（glycoprotein，G）共同作用，诱导病毒囊膜和细胞膜发生融合，具有较好的免疫原性。有研究者以NiV 的基因组DNA 为模板扩增F基因，插入 pALVAC 得到 pALVAC-F，转化BHK-21细胞株，挑选rCNPV-G重组病毒，Western blot 结果表明 rCNPV-G 中的 60 kD F 抗原可与患者的血清反应。同时将108PFU 重组病毒通过肌肉注射于仔猪体内，并在第1次接种后2周再重复 1 次，结果发现在第 1 次接种后 4 周血清 IgG 和中和抗体明显升高，滴度分别为1∶1 280 和1∶2 560，此时用2.5×105PFU尼帕病毒的有毒株进行滴鼻攻击，在攻击后6 d发现接种组脑和肺的病变明显减轻，且鼻咽拭子未检查出病毒负荷[11]。

1.2.4 亨得拉病毒（Hendra virus，HeV） HeV 可感染马、猪等哺乳动物，主要引起急性呼吸道感染或脑炎。提取HeV 的总RNA 作为模板扩增G/F基因，插入 pALVAC 得到 pALVAC-G/F，转化BHK-21 细胞株，挑选重组病毒，免疫荧光结果表明rCNPV-G 可以表达融合蛋白，提示成功构建了重组CNPV 疫苗。保护力试验表明，将105.4和107.4PFU 重组病毒分别皮下注射仓鼠，在初次免疫后3 周进行加强，在初次免疫后6 周提示血清IgG 和中和抗体有一定程度的提升，此时采用腹腔注射将104PFU 的HeV 进行攻击感染，在攻击感染后4周计算105.4PFU接种组、107.4PFU接种组和对照组的存活率，结果分别为54%（5/9）、100%（9/9）和0%（0/9）[12]。

1.3 逆转录病毒

1.3.1 艾滋病毒 艾滋病毒感染可导致获得性免疫缺陷综合征。该病毒的env基因编码前体蛋白gp160，gp160 可分解为 gp120 和 gp41。Cox 等[13]采用静脉注射的方法将5×107PFU的重组CNPV-env疫苗接种于BALB/c 鼠，并在第1 次接种后4 周重复 1 次。结果表明，血清 IgG 在第 1 次注射后 6 周达到较高水平，脾CTL反应在第1次注射后2周达到较高水平。

有研究表明，CD40 配体（CD40L）与 CD40 相互作用，可促进T 细胞、B 细胞和树突状细胞的成熟，进而促进免疫应答[14]。2008年，有研究者首先将 107PFU 的 rCNPV-CD40L 和 107PFU 的rCNPV-env 疫苗混合后，通过肌肉注射免疫BALB/c 鼠，并在初次注射后2、4周重复2次，结果表明在初次注射后10 周血清IgG 的滴度明显提升，脾细胞发生增殖，并分泌高水平INF-γ、IL-4等细胞因子，流式细胞仪证实脾IFN-γ+CD8+T 细胞数增加，随后通过肌肉注射将105.8TCID50的rCNPV-env 疫苗接种健康志愿者，在初次注射后1、3 和6 个月重复3 次，发现血清的中和抗体滴度在初次注射后182～546 d 明显提升，且在初次注射后378 d 提升最明显[15]。外周血单核细胞的CTL 反应在初次注射后42～728 d明显增强，并在初次注射后182 d 达到较高水平[16]。2009 年和2015 年，Kim 等[17]先后在泰国进行了Ⅱ期和Ⅲ期临床试验，结果表明重组CNPV-env疫苗初次免疫和gp120蛋白加强方案的有效率仅为31.2%，表明该疫苗的免疫效果有待进一步提升。

HIV-1 的gag基因编码核衣壳蛋白 P24、P7 和内膜蛋白P14。2002 年，有研究者将107TCID50的rCNPV-gag 疫苗和 50 μg 的重组 GP160 蛋白通过肌肉注射接种14 例AIDS 患者，并在初次接种后1、3 和 6 月重复 3 次，结果表明在初次接种后 7 个月，92.86%（13/14）的患者血清 IgG 滴度明显提升，流式细胞仪证实64.29%（9/14）患者的外周血单核细胞IFN-γ+CD8+T 细胞数目增加。随后在2005 年，研究者将 106.08TCID50的 rCNPV-gag 疫苗肌肉注射326 例AIDS 患儿，并在初次注射后4、8和12周重复3次，结果显示，患儿外周血单核细胞的CTL 反应在第1 次注射后6～104 周增强，并在初次注射后14周达较高水平[18-19]。

1.3.2 猴艾滋病毒（simian immunodeficiency virus，SIV） 猴艾滋病毒感染是猴免疫缺陷病的主要病因。2010 年，有研究者进行了一项将108PFU rCNPV-env 疫苗肌肉注射恒河猴（Macaca mulatta）的试验，结果表明在注射后2 周血清IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-15、IL17、TGF-β 等细胞因子表达水平明显升高[20]。

1.3.3 猫白血病病毒（feline leukemia virus，Felv） 猫白血病病毒感染可导致猫白血病，为了构建表达ENV 蛋白的重组CNPV 病毒，提取Felv的总 RNA 为模板扩增env基因，插入 pALVAC 得到pALVAC-env，转染CEF 细胞株，进行筛选和培养，免疫印迹提示患者血清识别重组病毒表达的70 kD 的 E2 蛋白和 63 kD 的 GAG 蛋白；保护力试验表明，借助皮下注射将108PFU重组病毒接种仔猫，并在初次接种后3 周重复1 次，在初次接种后5 周用 2×106PFU 猫白血病病毒 Glasgow 株进行口服加滴鼻攻击，结果表明在攻击后12 周血清中的中和抗体明显升高，血清中的病毒负荷明显降低。当将重组病毒接种仔猪或仔猫时，也可得到类似结果[21-24]。

1.4 双链RNA病毒

1.4.1 非洲马病病毒4 型 非洲马病病毒4 型感染是非洲马病的主要病因之一，外壳蛋白的主要成分VP2 和VP5 蛋白是两种较好的保护性抗原。2009 年，有研究者提取 AHSV-4 的总 RNA 为模板扩增VP2/VP5基因，并插入 pALVAC 得到pALVAC-VP2/VP5，转染 BHK-21 细胞株，挑选阳性病毒，免疫荧光检测提示阳性病毒可表达融合蛋白。随后，将107.1TCID50重组病毒肌肉注射Boerperd 马，并在初次接种后 4 周重复 1 次，结果表明在初次接种后8 周血清中的中和抗体明显提升，滴度为1∶20～1∶40，此时静脉注射105.5TCID50非洲马病病毒4型的有毒株进行攻击，在攻击后2周提示血清的病毒负荷降低。然后将重组病毒接种 Welsh 马，在第 1 次注射后 8 周提示血清 IgG 升高，流式细胞仪发现外周血单核细胞中IFN-γ+CD8+T细胞数明显增加[25-26]。

1.4.2 传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV） 传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白可诱导小鸡产生保护性的中和抗体。2014年，有研究者以IBDV 的总RNA 为模板扩增VP2基因，插入 pALVAC 得到 pALVAC-VP2，转染BHK-21 细胞株，挑选重组病毒，Western blot 发现rCNPV-VP2 中 37 kD 的 VP2 蛋白可被患者的血清结合。随后通过肌肉注射将5.5×105PFU 重组病毒免疫莱杭鸡，并在初次注射后32、53 d 加强2次，在初次注射后74 d发现血清的中和抗体升高，滴度为 1∶512[27]。

1.4.3 蓝舌病毒17 型 蓝舌病毒17 型感染家畜和野生啮齿动物后引起的疾病称为蓝舌病。外壳蛋白的主要成分VP2和VP5蛋白接种动物可产生中和抗体。2007 年，有研究者提取BTV-17 总RNA 作为模板扩增VP2/VP5基因，插入pALVAC得到 pALVAC-VP2/VP5，转染 BHK-21 细胞株，挑选阳性病毒，免疫荧光技术发现阳性病毒能表达融合蛋白。随后，将6.3×108PFU 重组病毒皮下注射绵羊，并在第1 次注射后3 周加强1 次，结果表明，在第1 次注射后5 周血清的中和抗体提升，抗体滴度达1∶40，此时，通过皮下注射将105.5TCID50蓝舌病毒17 型的有毒株进行攻击感染，在攻击后3周免疫组的血清无病毒负荷[28]。

1.5 黄病毒

1.5.1 西尼罗病毒（west Nile virus，WNV） 西尼罗病毒是西尼罗热的病原体，WNV 的表面含有前膜蛋白（pre-membrane protein，prM）和包膜蛋白（envelope protein，E），可在WNV 表面形成异二聚体，具有较好的免疫原性。为了验证rCNPV-PrM/E的保护效果，将105.6TCID50的重组病毒分别皮下注射猫和狗，在第1次注射后4周重复1次，在第1次注射后120 d 用10 只WNV 感染的白纹伊蚊叮咬30 min，在叮咬后13 d 提示接种猫和狗血清中的中和抗体明显升高，滴度分别为1∶305 和1∶320，血清的病毒负荷有一定程度的降低。随后进行的rCNPV-PrM/E 接种儿马实验提示接种组的存活率明显升高[29-30]。

1.5.2 丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒感染可引起丙型肝炎，非结构蛋白3（nonstructural protein 3，NS3）可诱导宿主产生一定的细胞和体液免疫应答。2000 年，有研究者提取 HCV 的 cDNA 作为模板扩增NS3基因，插入pRC/ATG 得到pRC-NS3，加ALVAC 转化COS-1 细胞株，挑选阳性病毒，Western blot 发现阳性病毒表达的70 kD 的NS3 蛋白可被患者的血清所识别。保护力试验表明，100 μg的pRC-NS3肌肉注射C57BL/6鼠后，在第1次注射后4、8周强化2次，在第1次注射后12周静脉注射5×107PFU 的rCNPV-NS3疫苗加强1次，结果表明在第1 次注射后16 周血清IgG 升高，脾细胞CTL反应增强，流式细胞仪证实脾IFN-γ+CD8+T细胞数增加。随后，将 50 μg 的 pRC-NS3 肌肉注射 HLA-AI-1+鼠，在第 1 次注射后 3 周加强 1 次，并在 第 1 次 注 射 后 6 周 静 脉 注 射 5×107PFU 的rCNPV-NS3疫苗加强1次，结果表明在第1次注射后14 周脾细胞CTL 反应增加，斑点酶联吸附实验证实脾IFN-γ+SFCs 的数目增加，此时腹腔注射107PFU 重组VV-C-NS3/HCV 嵌和病毒株进行攻击感染，结果表明在攻击感染后5 d接种鼠卵巢的病毒负荷明显减少[31-32]。

1.6 疱疹病毒

1.6.1 巨细胞病毒 巨细胞病毒常引起胎儿的先天性畸形。gB 蛋白可诱导中和抗体的产生。有研究者将106.5TCID50的rCNPV-gB 疫苗肌肉注射健康志愿者，在第 1 次注射后28、180 d 加强 2 次，结果表明血清IgG 和中和抗体在第1 次注射60～360 d 时升高，在第 1 次注射后 180 d 达到较高水平，滴度分别为1∶89 144 和1∶266，且该疫苗可诱导长时间的细胞免疫应答[33]。

1.6.2 马疱疹病毒1 型（equine herpes virus type 1，EHV-1） 马疱疹病毒1 型感染是马流产或神经系统疾病的病因之一，重组gB 蛋白是一种有效的免疫原。为了研制重组CNPV 疫苗，提取EHV-1 的基因组DNA 作为模板扩增gB基因，插入 pVR1012 得到 pVR1012-gB，并与 pALVAC 重组得到pALVAC-gB，转染Vero 细胞株，挑选阳性病毒，免疫荧光技术提示阳性病毒能表达融合蛋白。随后，通过肌肉注射将108TCID50重组病毒免疫Welsh矮种马，在第1次接种后5周重复1次，结果表明在第1 次接种后8 周血清IgG 和中和抗体的滴度升高，此时用105TCID50马疱疹病毒1 型的Ab4 株进行滴鼻攻击，在攻击后2 周发现血清的病毒负荷明显降低[34]。

1.7 狂犬病毒

狂犬病毒的狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RGP）可诱导宿主产生较好的保护力。有研究者将106.5TCID50的rCNPV-RGP 疫苗注射BALB/c 鼠，并在2 周后脑内注射16 半数致死量（median lethal dose，LD50）狂犬病毒CNS 株进行攻击，在攻击后4 周显示免疫组和对照组的存活率分别为 100%（10/10）和 0%（0/10）。之后，将107TCID50的rCNPV-RGP 疫苗皮下注射毕格犬，在注射后 26 d 发现血清 IgG 升高，滴度为 1∶5.3，此时肌肉注射3.52 LD50狂犬病毒NYGS 株进行攻击，在攻击后4周计算存活率，结果显示接种组和对照组存活率分别为 100%（4/4）和 0%（0/2）[35]。随后将rCNPV-RGP 疫苗接种健康志愿者、仔猫或幼鹿，试验结果表明该疫苗可诱导中和抗体的产生，并持续较长时间[36]。

1.8 兔出血热病毒

兔出血热病毒（rabbit haemorrhagic fever virus，RHDV）感染是兔出血热的病因。重组衣壳蛋白（recombinant capsid protein，Cap）是一种有效的免疫原。1997 年，有研究者提取RHDV 的总RNA 作为模板克隆Cap 蛋白的编码基因，插入pBSK（+）得到pBSK-cap，并与pALVAC 重组得到pALVAC-cap，转染CEF细胞株，进行筛选和培养，Western blot 方法显示，患者血清可结合重组病毒表达的 60 kD 的 CAP 蛋白。随后，将 105PFU 和107PFU 重组病毒接种兔，在第1 次接种后4 周重复1次，在第1次接种后6周显示，血清IgG和中和抗体的滴度升高，此时通过滴鼻将100 LD50的L4/90 株进行感染攻击，在攻击后2 周表明105PFU 接种组、107PFU 接种组和对照组的存活率分别为75%（3/4）、100%（4/4）和0%（0/6）[37]。

2 重组CNPV抗婴儿利什曼原虫

婴儿利什曼原虫感染可引起内脏利什曼病，俗称黑热病。长须鲁蛉（Lutzomyia longipalpis）是一种黑热病的传播媒介，LJM17 是该媒介的唾液蛋白，可诱导仓鼠产生一定的保护力。为了研究rCNPV-LJM17 疫苗的保护效果，有研究者先将250 μg 的 pNB0-LJM17 肌肉注射毕格犬，在第 1次注射后 4、6 周再肌肉注射 108PFU 的rCNPV-LJM17 疫苗强化 2 次，在初次注射后 10 周发现血清IgG 抗体及其IgG1 和IgG2a 亚类的滴度升高，IgG2a 水平高于IgG1，此时皮下注射107个婴儿利什曼原虫的前鞭毛体进行感染攻击，在攻击后10 个月发现接种犬皮损处的原虫负荷显著降低[38]。

3 展望

重组CNPV 载体介导的疫苗具有以下优点：①CNPV 仅感染禽类细胞，虽然也可一过性感染哺乳动物的细胞，但由于其DNA 的合成受到抑制，常导致该类细胞的流产性感染；②CNPV 的减毒株ALVAC 具有价格低廉、稳定、无需冷链存储等特点；③由于ALVAC减毒株不感染哺乳动物细胞，故在健康人群或免疫受累人群中不产生疾病；④该重组病毒具有自身的酶系统和调控信号，其转录、翻译和调控均在胞浆中进行，避免了病毒基因组插入宿主细胞染色体的可能性；⑤该重组病毒可刺激宿主产生全面的细胞、体液和黏膜免疫应答，免疫应答的持续时间较久。

现有CNPV 载体介导的病原体疫苗大部分只进行了接种小鼠、兔、毕格犬、幼猫、狐狸、大熊猫、仔猪、恒河猴、儿马或矮种马等的动物试验，尚未进行志愿者或感染者的接种试验；只有CNPV 载体介导的艾滋病毒、巨细胞病毒和狂犬病毒疫苗进行了健康志愿者的接种试验，但免疫效果不佳，尚需进行疫苗接种剂量、次数和间隔时间的优化，并探究不同类型疫苗的初免加强策略；CNPV 载体介导的艾滋病毒疫苗进行了接种艾滋病患者的试验，但治疗结果不佳，可能是因为患者体内存在一些免疫逃避或抑制策略，导致患者在接种疫苗后不能有效活化相应的免疫应答，并建立持续的记忆性免疫应答，提示这类疫苗的免疫机制尚需深入研究；CNPV 载体介导疫苗的非复制型机理研究尚不深入；表达载体缺乏高效启动子或增强子，表达效率通常较低；靶向性较差，不良反应较大；母源抗体的干扰可影响rCNPV的免疫效果。

随着科技的进步，人们对病毒和寄生虫的基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学以及表观遗传学等进行了深入研究，从而阐明了病毒和寄生虫蛋白的抗原结构与功能的关系。随着各种组学和规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9 基因编辑等高通量筛选和抗原功能鉴定技术的发展，可筛选出更多的保护性抗原分子，构建多价高效的复合基因疫苗或含有基因佐剂的混合基因疫苗或多表位疫苗。但未来仍需进行以下几个方面的研究以拓展重组CNPV 载体疫苗的应用前景：①探究这些疫苗的免疫原性、转化效率、MHC 限制性以及能否长期在宿主体内表达；②研究新型佐剂、疫苗载体和制备融合蛋白，提高疫苗的免疫原性；③在宿主体内准确评估新型疫苗分子的保护性免疫机制；④进一步探究病毒和寄生虫蛋白家族及其他相关蛋白生物学功能，提升疫苗的设计水准；⑤探究纳米微粒技术引入新型疫苗能否延长免疫应答的时间，并诱导记忆性T 细胞的产生。