超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中维生素D3

程传民 ， 李 云 ， 谷 明 ， 徐定慧 ， 邝婷婷 ，王宇萍 ， 冯 波 ， 赵立军 ， 张 静 ， 童 琪

（1.四川省饲料工作总站，四川成都 610041；2. 阿坝藏族羌族自治州农业农村局种子站，四川阿坝藏族羌族自治州 624009；3.四川省草原科学研究院，四川成都 611731）

维生素D3的基本功能是参与体内钙、 磷代谢，促进肠道钙、磷吸收，调整钙、磷吸收比例，促进骨的钙化和正常发育（Cashman 和Kiely，2016；Spiro 和 Buttriss，2015；Jetter 等 ，2014；Cashman等，2012；Borradake 和 Kimlin，2009）。 缺乏维生素D3，即使钙、磷充足，也不能在骨骼中很好的沉积；维生素D3过量可产生过多症（Martinez 等，2017；Rodeny 等 ，2017；Zhou 等 ，2016；Hines 等 ，2013；Lauridsen 等，2010），表现为血钙过多，组织、器官钙盐沉积，骨骼易折（刘亚楠等，2020；徐宏建等，2020；Duffy 等 ，2018；Ren 等 ，2018；Rodney 等 ，2018；Duffy 等，2017）。 因此准确检测饲料中维生素D3十分必要。

现行的饲料中维生素 D3检测方法（GB/T 17818—2010）为液相色谱法，出峰时间有其他物质干扰，无法准确定量；需要进行色谱柱的二次分离，检测效率较低；且该方法检出限较高不适用于饲料原料中维生素D3的检测。 本研究拟采用超高效液相色谱-串联质谱检测内标法解决上述问题。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 1290/6495 超高效液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾源，美国Aglient 公司）；维生素D3、维生素D2标准品（德国 Dr. Ehrenstorfer 公司）；甲醇（色谱纯，美国 Fisher Scientific 公司）； 甲酸 （色谱纯，Fluka 公司），Bond Elut ENN固相萃取柱 （美国Agilent 公司）、Bond Elut Plexa固相萃取柱 （美国 Agilent 公司）；Captiva EMRLipid 净化柱（美国 Agilent 公司）

饲料样品：猪配合饲料、禽配合饲料、浓缩饲料、饲料原料。

1.2 溶液配制 维生素D3标准储备液：称取10 mg维生素D3（胆钙化醇）标准品于50 mL 棕色容量瓶中， 用色谱纯无水乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，-20 ℃保存。该储备液浓度为 200 μg/mL，有效期3 个月。

标准中间液： 取1.00 mL 储备液用色谱纯无水乙醇定容到100 mL 容量瓶，-20 ℃保存， 该中间液质量浓度2.0 μg/mL，有效期1 个月。

维生素D2内标工作液： 称取100 mg 维生素D2（钙化醇）标准品于100 mL 棕色容量瓶中，用色谱纯无水乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，该液浓度为 1.0 mg/mL。 用甲醇稀释 10 倍，配制成 100 μg/mL内标工作液。

标准系列溶液：准确吸取维生素D3标准中间液 0.10、0.20、0.50、2.50、5.00、12.50 mL 于 100 mL棕色容量瓶中， 各加入维生素D2内标工作溶液1.00 mL，用甲醇定容至刻度，混匀。此标准系列工作液浓度分别为 2.0、4.0、10.0、50、100、250 μg/L。

1.3 色谱和质谱条件 Thermo BDS HYPERSIL C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.4 μm）；柱温：35 ℃；进样体积：2 μL；流速：300 μL/min；流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正模式；毛细管电压：正模式3500 V；负模式：3000 V；干燥气温度：250 ℃；干燥器流速：10 L/min；雾化气压力：35 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速 11 L/min；EMV：300 V。监测离子对（m/z）和其他参考条件参见表2。

表2 质谱选择反应监控参数

1.4 样品前处理条件 称取2 g 试样于50 mL具塞离心管中， 加入100 μL 维生素D2内标工作溶液（100 μg/mL）和 0.4 g 抗坏血酸，加入 6 mL约 40 ℃温水，涡旋 1 min，加入 12 mL 乙醇，涡旋30 s，再加入 6 mL 氢氧化钾溶液（500 g/L），涡旋30 s 后， 放入恒温振荡器中，80 ℃避光恒温水浴振荡30 min，取出放入冷水浴降温。

向冷却后的皂化液中加入20 mL 正己烷，涡旋提取3 min，7000 r/min 条件下离心3 min。转移上层清液到50 mL 离心管，加入25 mL 水，轻微晃动30 次，在7000 r/min 条件下离心3 min，取上层有机相在40 ℃下氮气吹干， 加入体积分数80%的甲醇溶液5.0 mL，备用。

用体积分数80%甲醇水溶液2 mL 活化净化小柱Bond Elut Plexa，全部样液上柱，再用80%的甲醇水溶液2 mL 淋洗小柱， 抽干，4 mL 丙酮洗脱，40 ℃氮气吹干，1 mL 甲醇复溶，过膜，供 LCMS/MS 检测。

2 结果与讨论

2.1 皂化和提取条件的研究 目前， 维生素D3检测过程中影响检测效率的主要因素是皂化和提取过程，本研究在不改变皂化原理的前提下，通过将回流改成水浴振荡，乙醚提取改成正己烷提取，减少提取次数和洗涤次数， 采用实际样品与标准方法比较提取效率，结果能够满足要求。

2.2 净化条件的优化 根据维生素D3的化学性质，选取吸附特性为非极性的净化小柱Bond Elut ENN 和Bond Elut Plexa。 同时比较了吸附杂质性固相萃取柱Captiva EMR-Lipid。考察净化小柱的回收率。 其中，Bond Elut ENN 小柱回收率低于50%，Captiva EMR-Lipid 净化效果不明显，通过优化固相小柱净化条件，Bond Elut Plexa 净化小柱回收率达可到90%左右，通过液相考察维生素D3色谱峰峰型对称，峰纯度高，由此可见，Bond Elut Plexa 小柱可以实现饲料中维生素D3的净化。

2.3 基质效应考察 基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰（陈小华和汪群杰，2009）。基质效应主要是由质谱检测器的离子化过程产生的，在电喷雾时， 基质内的组分与目标化合物共同流出喷雾针，影响目标物的雾化、挥发、分裂、化学反应及带电过程，致使进入质谱的离子减少或增加，从而影响定量分析的可靠性和准确性 （苏萌和艾连峰，2014；王立琦等，2011）。通过实验发现，基质对目标化合物响应存在明显的增强作用， 因此在实际检测过程中， 用标准曲线定量会对回收率造成影响。 在液相色谱-串联质谱法中，补偿基质效应的方法有基质匹配标准溶液的校正、 同位素标记法、加入分析保护剂、优化进样技术等（刘洪斌等，2011；蒋施等，2010），本实验基质抑制效应明显，因此采用维生素D2作为内标进行定量，在经济条件较好的情况下，可以采用维生素D3的同位素内标。

2.4 色谱柱的选择 维生素D3在一般的C18 色谱柱上有较好的保留，本方法比较了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）、Agilent SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Thermo BDS HYPERSIL C18 （2.1 mm× 100 mm，2.4 μm）色谱柱，经使用标准工作液对各规格色谱柱进样分离得色谱质谱图。由实验结果可见，在本研究的液相条件下，Thermo BDS HYPERSIL C18（2.1 mm×100 mm，2.4 μm） 色谱柱峰型和灵敏度较好。 标准液的特征离子流图见图1。

图1 维生素D3 和维生素D2 标准品的特征离子色谱图（MRM）

2.5 流动相选择 为了实现VD3峰型对称、响应高的要求，本研究采用常用的甲醇-水做流动相，为增加VD3的离子化效率，在水相中加入体积分数0.2%的甲酸，经比较使用不同比例的甲醇进行洗脱，甲醇比例为95%（V：V）时最为理想，且能够在较短时间内得到很好的峰型； 甲醇比例更高时响应明显下降。本方法最终确定用0.2%的甲酸和甲醇做流动相（表1）。

2.6 方法学考察

2.6.1 方法的线性、检出限和定量限 维生素D3在MRM 方式下的灵敏度除取决于本身的结构原因外， 主要与离子化的效率有关。 本方法采用以空白样品加标实验的3 倍信噪比（S/N）为方法的检出限；将特定浓度的维生素D3加入到空白样品中，然后按本方法对样品预处理。 经质谱检测，得本方法的定量限。具体曲线方程、检出限和定量限见表3。

表3 线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

2.6.2 方法准确度与精密度 为考察方法的准确度和精密度，采用不同样品基质进行了添加实验，按照定量限、 中间浓度和实际添加浓度进行3 个梯度的添加，所得实验结果如表4 所示。平均回收率为70.1% ~ 93.6%，批内相对标准偏差为3.8% ~8.3%，批间相对标准偏差为5.1% ~ 6.9%，表明该方法具有较好的准确度和精密度。

表4 方法精密度与准确度

2.6.3 实际样品检测 选择5 份含有维生素D3的仔猪配合饲料， 按本方法优化条件进行前处理后分别上液相和LC-MS/MS 测定，液相色谱峰保留时间处未见杂质峰干扰， 可见本研究前处理方法也可用于液相检测。 液相结果和LC-MS/MS 结果相对偏差小于10%， 均在理论含量偏差范围内。表明本方法具有实验结果可比性，检测结果准确、可靠。

3 结论

本研究采用更加便捷的皂化法提取， 用固相萃取法进行净化，内标法定量分析，建立了液相色谱-串联四级杆质谱检测饲料中维生素D3含量的分析方法。 实验结果表明， 该方法的检出限为2.0 μg/kg，定量限为 5.0 μg/kg；在 2 ~ 250 μg/kg定量范围内线性关系良好（r>0.995）；添加回收率为 70.1% ~ 93.6%；RSD＜10%。 方法批量操作性强，灵敏度高，具有较好的精密度与准确度。