广西南宁甘蔗赤条病调查及分子检测

李婕 单红丽 王长秘 仓晓燕 王晓燕 张荣跃 房超 韦美英 马燕青 黄应昆

摘要

2020年在廣西南宁市金光农场发现‘桂糖58’和‘柳城05136’疑似感染甘蔗赤条病，为明确其病原，本研究对不同甘蔗品种进行了发病率调查，并采集病样进行了PCR检测分析。田间调查结果表明：不同品种自然发病率不同，‘桂糖58’发病率为29%～52.33%，发病严重田块平均发病率为49.67%，发病中等田块平均发病率为33.67%，发病较轻田块平均发病率为29.89%;‘柳城05136’发病率为2%～27.67%，发病严重田块平均发病率为21.67%，发病中等田块平均发病率为21.22%，发病较轻田块平均发病率为4.67%。PCR检测分析表明：有19份样品扩增出550 bp的特异性条带，阳性检出率为95%，测序序列与Acidovorax avenae subsp. avenae 序列同源性高达100%，且在构建的系统发育树上处于同一分支，证实检测样品为A.avenae subsp. avenae感染引起的甘蔗赤条病。本研究结果表明，‘桂糖58’为高感品种，‘柳城05136’为感病品种，今后应积极采取相应防控措施，防治该细菌病害扩展蔓延，确保我国蔗糖产业安全可持续发展。

  关键词

广西;甘蔗赤条病;发病率;PCR检测;系统发育分析

中图分类号：

S435.661

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020662

Investigation and molecular detection of sugarcane red stripe caused by Acidovorax avenae subsp. avenae in Nanning， Guangxi

LI Jie1，SHAN Hongli1，WANG Changmi1，CANG Xiaoyan1，WANG Xiaoyan1，

ZHANG Rongyue1，FANG Chao2，WEI Meiying2，MA Yanqing2，HUANG Yingkun1*

（1. Sugarcane Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Science， Yunnan

Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement， Kaiyuan661699， China; 2. Guangxi

Keimike Agricultural Technology Service Co. Ltd.， Nanning530000， China）

Abstract

In 2020， suspected sugarcane red stripe disease was found in ‘Guitang 58’ and ‘Liucheng 05136’ in Jinguang farm， Nanning city， Guangxi. In order to identify the pathogen， we investigated the incidence of different sugarcane varieties， and collected disease samples for PCR molecular detection and sequencing analysis. Field survey results showed that the incidence  of different varieties were different. The disease incidence in ‘Guitang 58’ was 29%-52.33%， the average disease incidence of severely， moderately and lighter affected fields was 49.67%， 33.67%， 29.89%， respectively. The disease incidence in ‘Liucheng 05136’ was 2%-27.67%， the average disease incidence of severely， moderately and lighter affected fields was 21.67%， 21.22% and 4.67%， respectively. PCR analysis showed that 19 samples amplified a 550 bp specific band with a positive detection rate of 95%. And the obtained sequences had 100% homology and were on the same branch with Acidovorax avenae subsp. avenae in phylogenetic tree， which confirmed that the tested samples were sugarcane red stripe disease caused by A.avenae subsp. avenae. The above results showed that ‘Guitang 58’ was highly susceptible variety and ‘Liucheng 05136’ was susceptible variety. In the future， corresponding prevention and control measures should be actively taken to prevent the spread of the bacterial disease and ensure the safe and sustainable development of sugar industry in China.

Key words

Guangxi;sugarcane red stripe disease;incidence;PCR detection;phylogenetic analysis

由燕麦噬酸菌燕麦亚种Acidovorax avenae subsp. avenae引起的甘蔗赤条病（sugarcane red stripe disease）是一种世界性甘蔗细菌病害[1]。感病甘蔗叶片初期出现水渍状褪绿条纹，很快发展成明显的红色条纹，长度和宽度不等，感染侵入顶端生长点可导致蔗茎坏死[2]。该病害于1890年在美国夏威夷首先报道[3]，目前在美国、澳大利亚、印度、古巴、伊朗、阿根廷、巴基斯坦和加蓬等50多个植蔗国家和地区均有发生[2 12]，曾在阿根廷、巴基斯坦等甘蔗种植国暴发流行，给当地蔗糖产业造成严重经济损失[2， 12 13]。由黄单胞杆菌属Xanthomonas sp. [14]和链格孢属Alternaria sp. [15]真菌引起的甘蔗叶部病害症状与A.avenae subsp. avenae引起的甘蔗赤条病症状相似，感病蔗叶均会产生红色或红褐色条纹，仅从发病症状进行诊断容易误诊。

近年来，甘蔗赤条病在我国云南、广东、广西、福建蔗区均有报道，多为局部零星发生[16 18]。2020年，本团队在广西南宁市金光农场叫琳基地‘桂糖58’和‘柳城05136’甘蔗上发现疑似甘蔗赤条病症状， 准确进行病原的鉴定是病害精准科学防控的基础和关键。为此，本研究结合田间发病症状、PCR分子检测及测序分析进行了病原鉴定，并对不同品种自然发病率进行了调查统计，研究结果可为不同区域甘蔗品种布局及甘蔗赤条病的抗性鉴定提供参考依据。

1材料与方法

1.1病害调查及样品采集

2020年5月，在广西壮族自治区南宁市金光农场叫琳基地发现‘桂糖58’（一年宿根）和‘柳城05136’（一年宿根）疑似感染甘蔗赤条病，每个品种按发病重、中、轻各随机选择3个点取样调查，每个点取3行各300株有效蔗株调查发病情况，记录发病株数，观察并记录病害症状。按以下公式计算发病率。

发病率=（发病株数/调查总株数）× 100%。

1.2蔗叶总DNA的提取

采集20份具有典型症状的甘蔗植株，称取各待测发病甘蔗叶片0.2 g，加入液氮研磨成粉狀，采用北京全式金生物技术公司的 Easy Pure plant Genomic DNA Kit按照说明书方法提取叶片总DNA，用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析仪检测提取DNA质量， 20℃保存备用。

1.3甘蔗赤条病菌PCR检测

参照Song等[19]根据甘蔗赤条病菌16S23S核糖体ITS区域设计的特异性引物Oaf1：5′ GTCGGTGCTAACGACATGG3′和Oar1：5′AGACAT

CTCCGCTTTCTTTCAA3′、反应体系及扩增程序进行甘蔗赤条病菌PCR检测，预期目的片段长度为550 bp。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。阳性对照甘蔗赤条病菌基因组DNA为云南省甘蔗遗传改良重点实验室鉴定保存，阴性对照为健康组培苗，空白对照为无菌双蒸水。

1.4PCR产物克隆、测序及序列分析

PCR扩增目的片段用北京天根生化科技有限公司琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。纯化的PCR产物用全式金生物科技有限公司的pEASYT5 Zero Cloning Kit进行克隆，并转化E.coil DH5α感受态细胞，选取10个样品各挑取6个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测序结果首先在GenBank进行BLAST检索，然后用MEGA 6.0软件进行序列分析，并构建系统进化树。

1.5数据分析

采用DPS V18.10 进行数据整理及分析，并对结果进行Duncan氏新复极差法分析比较差异显著性。

2结果与分析

2.1甘蔗赤条病田间症状观察

甘蔗赤条病最初表现为水渍状褪绿条纹，不久即扩展为长条状红色病斑，最后变为栗色或深红色。条纹通常发生于嫩叶中部近中脉处（图1a），有些则集中于叶基部（图1b）。条纹与叶脉平行，病健交界明显，宽0.5～4 mm，长几厘米至蔗叶全长（图1c）。常常2条或数条条纹合并连接形成宽带状病斑（图1d）。病叶下表皮通常可见细菌溢出物。心叶受到病菌的侵染，后期可导致心叶腐烂，心叶很容易从叶鞘中拉出，并发出特殊恶臭（图1e）。

2.2甘蔗赤条病发生情况调查

对疑似甘蔗赤条病为害的‘桂糖58’和‘柳城05136’田间发病情况进行调查统计分析（表1）。结果显示：‘桂糖58’发病率为29%～52.33%;发病严重田块，发病率为45%～52.33%，平均发病率为49.67%;发病中等田块，发病率为30%～40.67%，平均发病率为33.67%;发病较轻田块，发病率为29%～30.67%，平均发病率为29.89%。‘柳城05136’发病率为2%～27.67%;发病严重田块，发病率为16%～27.67%，平均发病率为21.67%;发病中等田块，发病率为18.33%～26.33%，平均发病率为21.22%;发病较轻田块，发病率为2%～9%，平均发病率为4.67%。

显著性分析表明（表1），‘桂糖58’发病严重田块与发病中等、发病较轻田块的平均发病率差异显著，后两者之间差异不显著;‘柳城05136’发病严

重、发病中等田块与发病较轻田块的平均发病率差

异显著，发病严重田块与发病中等田块的平均发病率差异不显著。

2.3甘蔗赤条病菌PCR检测

对典型症状样品进行了甘蔗赤条病特异性PCR检测，结果显示，20份样品中，19份样品和阳性对照均能扩增出大小约550 bp的目的条带，而阴性对照和空白对照均未扩增出预期目的条带（图2），表明检测样品为A.avenae subsp. avenae感染引起的甘蔗赤條病。

2.4序列分析

从PCR检测阳性样品中随机选取10个PCR产物进行测序，大小均为550 bp。通过BLAST比对，选择其中2个序列进行进一步分析，序列（GenBank登录号：MW280446MW280447）与A.avenae subsp. avenae （GenBank登录号：AY080998）16S23S rDNA核苷酸序列相似性达98.05%，与广东湛江‘云蔗082060’上的A.avenae subsp. avenae（GenBank登录号：KY363756）序列同源性高达100%。系统进化分析表明，所得序列与A.avenae subsp. avenae处于同一分支上，亲缘关系最近（图3），进一步证实了检测样品为A.avenae subsp. avenae感染引起的甘蔗赤条病。

3讨论

仅通过田间发病症状进行诊断容易导致误判，基于PCR分子检测技术进行快速分子诊断具有准确、快速、高效等特点，已广泛应用于各种病害的检测和鉴定。目前已建立成熟稳定的甘蔗赤条病分子检测方法，即Song等根据A.avenae subsp. avenae的16S23S核糖体ITS区域设计的特异性引物Oaf1/Oar1，扩增目的条带大小约为550 bp[19]。 本研究利用该引物对，对广西南宁市金光农场叫琳基地‘桂糖58’和‘柳城05136’疑似甘蔗赤条病样品进行了PCR扩增及测序分析，证实检测样品为A.avenae subsp. avenae感染引起的甘蔗赤条病。

A.avenae subsp. avenae寄主范围广泛，除侵染甘蔗外，还可侵染多种禾本科植物，包括玉米、水稻、高粱、黍、燕麦、大麦、小米和狐尾草Setaria viridis等[19 25]，这些中间宿主为甘蔗赤条病的发生危害提供了初侵染源。近年来，甘蔗赤条病在我国广西、云南、广东、福建等蔗区零星发生，但部分蔗区发病率高达80%[16]。田间调查发现：‘云蔗03194’高度感病，发病率一般为8%～30%，严重田块高达80%[16]，‘福农38号’为感病品种，发病率为23%[17]，‘ROC 16’‘ROC 25’‘粤糖93159’‘粤糖00236’‘桂糖94116’‘桂引5号’和‘闽糖11610’也为感病品种[18，26]。本研究在广西南宁市金光农场叫琳基地发现甘蔗赤条病，并进行了田间自然发病率调查，明确了‘桂糖58’为高感品种，发病率为29%～52.33%;‘柳城05136’为易感品种，发病率为2%～27.67%。因此，今后各蔗区调种、运种时应加强对该病害的检疫和监测，防止该病害随蔗种在各蔗区传播蔓延，同时应及时清除病株。此外，在品种布局时，应避免在赤条病发生区种植‘桂糖58’‘柳城05136’和‘云蔗03194’等高感或易感赤条病品种。

A.avenae subsp. avenae属于革兰氏阴性菌，最适生长温度为30～35℃[27]，致死温度为51～52℃[28]。在田间主要靠风、雨传播，也可通过蔗种、机械损伤、昆虫等进行传播[18，28]，该病原菌可在土壤中存活长达1个月，感病枯老蔗叶、蔗茎中的病原体4个月后仍有致病力[28]。由于甘蔗是无性繁殖作物，甘蔗赤条病可通过蔗种进行传播，而蔗种温水处理脱毒技术已广泛应用于甘蔗宿根矮化病的防控，并取得较好的效果[29 30]。因此，除了种植抗病品种、化学防控及科学田间管理等措施外，今后可考虑开展甘蔗赤条病温水脱毒处理防控效果研究，为该病害的防控提供一条经济、有效的新途径。

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收稿日期：2020 12 10修订日期：2021 01 06

基金项目：

国家现代农业产业技术体系（糖料）建设专项资金（CARS170303）;云岭产业技术领军人才培养项目（2018LJRC56）;云南省现代农业产业技术体系建设专项资金（YNGZTX-4-92）

* 通信作者

Email：huangyk64@163.com