我国太子参主产区病毒病发生情况调查

王蓉 李勇 魏若凡 陈炳蔚 王天佑 丁万隆

摘要

為调查我国太子参主产区病毒病发生情况，使用RTPCR法对采自福建省柘荣县，贵州省施秉县、丹寨县和安徽省宣城市的71份具有典型病毒病症状的太子参样品进行检测，并根据CP氨基酸序列对不同地区病毒进行系统进化分析。RTPCR结果显示，65份样品检出病毒，检出率为91.55%，其中，56份样品检出芜菁花叶病毒Turnip mosaic virus（TuMV），49份样品检出蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2（BBWV2）， 9份样品检测出黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus（CMV），检出率分别为78.87%、69.01%和12.68%。未检测到烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）。序列和系统发育进化分析显示，本研究获得的TuMV、BBWV2和CMV与NCBI数据库中的序列相似度较高，核苷酸相似度分别为98.05%～98.98%、93.61%～94.25%和98.02%～99.17%，氨基酸序列相似度分别为：96.14%～97.47%、97.33%～98.50%和98.00%～100%，分别属于WorldB组、Ⅰa亚组和Ⅱ组。

  关键词

太子参;芜菁花叶病毒;蚕豆萎蔫病毒2号;黄瓜花叶病毒;系统进化分析

中图分类号：

S435.67

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020584

Investigation on the occurrence of virus diseases in the main producing areas of Pseudostellaria heterophylla in China

WANG Rong1，LI Yong1，WEI Ruofan1，CHEN Bingwei1，WANG Tianyou1，2，DING Wanlong1*

（1. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and

Peking Union Medical College， Beijing100193， China; 2. College of Traditional Chinese

Medicine， Jilin Agricultural University， Changchun130118， China）

Abstract

To investigate the occurrence of viral diseases in the main producing areas of Pseudostellaria heterophylla in China， reverse transcription polymerase chain reaction （RTPCR） was used to detect the viruses in 71 P.heterophylla samples with typical viral symptoms collected from Zherong county in Fujian province， Shibing county and Danzhai county in Guizhou province， and Xuancheng city in Anhui province. Phylogenetic analyses based on the CP amino acid sequences of the viruses from different regions were carried out. The results of RTPCR showed that 65 samples were infected by virus（es）， with a detection rate of 91.55%. Among them， Turnip mosaic virus （TuMV） were detected in 56 samples，Broad bean wilt virus 2 （BBWV2） were detected in 49 samples， while Cucumber mosaic virus （CMV） were detected in nine samples， with the detection rates of 78.87%， 69.01% and 12.68%， respectively. Tobacco mosaic virus （TMV） was not detected in all samples. Sequences and phylogenetic analyses showed that the nucleotide sequences of TuMV， BBWV2 and CMV obtained in this study shared 98.05% 98.98%， 93.61% 94.25% and 98.02% 99.17% nucleotide identities and 96.14% 97.47%， 97.33% 98.50% and 98.00% 100% amino acid identities with the sequences in National Center of Biotechnology Information （NCBI） database， respectively. The TuMV， BBWV2 and CMV isolates obtained in this study belong to group WorldB， subgroup Ⅰa and group Ⅱ， respectively.

Key words

Pseudostellaria heterophylla;Turnip mosaic virus;Broad bean wilt virus 2;Cucumber mosaic virus;phylogenetic tree

太子参Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax又名孩儿参、童参，石竹科Caryophyllaceae草本植物，是我国传统名贵中药材，也可作为保健食品。其块根入药具有益气健脾、生津润肺之功效[1]。自太子参人工种植以来，病毒侵染引起的太子参花叶病便是影响太子参生产的重要病害之一。其症状表现为植株矮小，叶片花叶、环斑、皱缩，根系减少，块根变小[2]。太子参以块根进行无性繁殖，病毒经无性繁殖材料直接传播给下一代，使得太子参病毒病呈逐年加重趋势，严重时导致优质太子参品种退化。据调查，太子参主产区病毒病发病率可达60%～90%，甚至100%，严重危害太子参的产量和质量[2 -3]。

在我国，侵染太子参的病毒主要有4种：芜菁花叶病毒Turnip mosaic virus（TuMV）、蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2 （BBWV2）、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus （CMV）和烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）[4 -5]。酶联免疫吸附法（ELISA）和反转录PCR（RTPCR）是两种常用的太子参病毒病检测方法。高玮等[6]、黄勇毅等[3]使用ELISA法分别对太子参中的TMV和CMV进行了检测。匡云波等[7]根据病毒较保守的外壳蛋白（coat protein， CP）序列，设计特异性引物，建立了太子参TuMV和BBWV2的双重RTPCR检测体系。在RTPCR检测的基础上，匡云波等获得并分析了不同产地太子参TuMV和BBWV2的序列差异，发现太子参TuMV均聚类在WorldB 组，并呈现一定的地域特异性[8];太子参BBWV2江苏、贵州、湖南、福建分离物聚类在Ia 亚组，而山东分离物聚类在Ⅱc亚组，遗传距离较远，呈现一定的地域特异性[9]。目前，未见关于CMV和TMV太子参分离物基因序列和系统进化树分析的研究报道。

我国太子参已有近百年的栽培历史，以福建柘荣，贵州施秉、丹寨和安徽宣城的产量较大，占据了太子参的主流市场[10]。因此，本研究在上述地区分别采集具有疑似病毒症状的太子参叶片样品71份，提取植物叶片总RNA，通过RTPCR，使用TuMV、BBWV2、CMV和TMV的特异性检测引物，检测各样品中带毒情况，扩增获得病毒CP基因片段，通过序列测定、BLASTn分析和系统发育进化树构建，分析不同地区TuMV、BBWV2和CMV的遗传进化关系。这些数据对于深入了解我国太子参主产区病毒病发生情况，开展太子参病毒病防控策略研究具有重要意义。

1材料和方法

1.1样品采集与试验试剂

2020年6月至7月在福建、贵州、安徽三省太子参主产区采集具有花叶、环斑、褪绿斑驳、叶片皱缩等疑似病毒症状的太子参叶片71份，其中，福建柘荣县宫溪镇宫溪村，采集样品8份，分别编号为GX1～GX8，黄柏乡黄柏村采集样品16份，分别编号为HB1～HB16，英山乡半岭村采集样品8份，分别编号为BL1～BL8;贵州施秉县城關镇上翁哨村采集样品8份，分别编号为CG1～CG8，牛大场镇牛大场村采集样品6份，分别编号为NDC1～NDC6，丹寨县兴仁镇中营村采集样品12份，编号分别为DZ1、DZ2、DZ3、DZ4、DZ7、DZ11、DZ14、DZ15、DZ17、DZ22、DZ24和DZ28;安徽省宣城市黄渡乡乌边村采集样品13份，分别编号为XC1～XC13，样品采集后，使用液氮速冻，置于 80℃保存。

试剂：TRNzol、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;MMLV反转录酶购自Promega公司;pMD19T Vector、T4 DNA Ligase、Ex Taq polymerase、RNase Inhibitor等购自TaKaRa公司;EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs、Random hexamers primer、Oligo d（T）18、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。引物合成和序列测定由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2叶片总RNA提取

取0.1 g太子参叶片在液氮中充分研磨，使用TRNzol试剂提取叶片总RNA，具体步骤参照说明书，提取的总RNA溶于30 μL DEPC处理的超纯水，置于 80℃保存备用。

1.3RTPCR检测

以1 μg总RNA为模板，Random hexamers primer和Oligo d（T）18为引物，使用MMLV反转录酶进行反转录，合成cDNA第一链。反应体系为：总RNA 1 μg，dNTPs（2.5 mmol/L，无RNase）1 μL，Random hexamers primer和Oligo d（T）18各0.5 μL，DEPC处理的超纯水补充体系至18.5 μL，70℃金属浴5 min，冰上1 min，短暂离心后加入5×MMLV反转录酶buffer 5 μL，MMLV反转录酶1 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，37℃水浴1 h。获得的cDNA用于TuMV、BBWV2、CMV和TMV检测。其中，BBWV2、TuMV和TMV的检测引物参照文献合成，检测区域均为病毒的CP基因;CMV检测引物，BBWV2和TuMV CP扩增引物根据NCBI数据库病毒序列使用Primer Premier 6.0 软件设计，扩增区域为病毒完整的CP基因（表1）。 PCR反应体系为： cDNA模板1 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1 μL，10 μmol/L正向、反向引物各1 μL，EasyTaq   DNA聚合酶（5 U/μL） 0.25 μL，10×EasyTaq buffer 2.5 μL，超纯水补充体系至25 μL。PCR反应程序：94℃预变性3 min;94℃ 变性30 s，52～53℃退火30 s，72℃延伸45 s～2 min，32个循环;72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4TuMV、BBWV2和CMV CP基因扩增

以太子参样品的cDNA为模板，使用Ex Taq DNA聚合酶及病毒CP基因的特异性扩增引物（表1）进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的条带，并将目的条带连接到pMD19T载体，转化大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，送至北京擎科生物科技有限公司测序。

1.5序列比对分析

使用NCBI网站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTn程序和DNAMAN 6.0软件对所得序列进行比对分析。在GenBank数据库下载获得18个TuMV核苷酸序列，17个BBWV2 核苷酸序列和15个CMV核苷酸序列，使用MEGA X软件[12]中的ClustalW程序进行比对，并使用邻接法（neighbor joining）分别构建TuMV、BBWV2和CMV CP的系统发育进化树，Bootstrap为1 000。

2结果与分析

2.1福建、贵州、安徽太子参带毒情况RTPCR检测结果

来自福建、贵州和安徽3省的71份样品中，有65份样品被检出病毒，检出率为91.55%，其中，56份样品检出TuMV，49份样品检出BBWV2，9份样品检测出CMV，检出率分别为78.87%、69.01%和12.68%。TMV未检出。福建省的32份样品全部检测出TuMV和BBWV2，其中5份样品还检测出CMV。贵州省的26份样品中，18份样品检测出TuMV，5份样品检测出BBWV2，检出率分别为69.23%和19.23%，其中，3份样品同时检测到TuMV和BBWV2，检出率为11.54%。未检测到CMV。牛大场村的6份样品未检测到上述4种病毒。安徽省的13份样品中，6份样品检测出TuMV，12份样品检测出BBWV2，4份样品检测出CMV，检出率分别为46.15%、92.31%和30.77%。4份样品检测到TuMV、 BBWV2和CMV 3种病毒，1份样品检测到TuMV和BBWV2 2种病毒（表2）。以上结果表明，福建省和安徽省太子参病毒病发生率最高，均为100%，贵州省太子参病毒病发生率较高，为76.92%。

2.2不同产地太子参TuMV CP基因克隆及系统进化树分析

结合RTPCR检测结果，选择福建省的GX1、HB1和BL2，贵州省的DZ1、DZ2和CG5，安徽省的XC4 7个TuMV阳性样品进行CP基因的序列及系统进化树分析。使用TuMV CP基因全长扩增引物TuMV8435F和TuMV9715R进行PCR扩增，产物经测序显示均为1 281 bp（图1）。TuMV GX1、HB1、BL2、DZ1、 DZ2、CG5和XC4分离物的序列均上传到NCBI数据库，GenBank登录号分别为：MW192531、MW192527、MW192530、MW192528、MW192529、MW192532和MW192533。 经BLASTn分析确定上述7个分离物均与TuMV KW778J分离物（GenBank登錄号：AB252124）核苷酸序列相似性最高，为98.05%～98.98%。经ORF Finder分析，7个分离物的扩增片段均编码1个多聚蛋白（395 aa），包含部分NIb蛋白（107 aa）和完整的CP蛋白（288 aa）。BLASTp分析发现上述7个分离物与已报道的TuMV多聚蛋白氨基酸序列相似性为96.14%～97.47%。

在NCBI数据下载了18个TuMV序列，用于构建系统发育进化树。系统进化分析显示：所有TuMV分离物可分为WorldB、BasalBR、AsianBR和BasalB 4个组，其中，本研究获得的7个TuMV分离物与已报道的TuMV太子参分离物TuMVGZ1、TuMVJS2、TuMVSD1、TuMVFJ/ZS11和TuMVFJ/ZS22亲缘关系最近，属于WorldB组（图2）。福建的HB1和GX1分离物，与贵州的TuMVGZ1分离物和江苏的TuMVJS2分离物聚为一支;贵州的CG5分离物和安徽的XC4分离物与福建的TuMVFJ/ZS11和山东的TuMVSD1聚为一支;福建的BL2和贵州的DZ1、DZ2分离物与福建的TuMVFJ/ZS22分离物聚为一支（图2）。说明侵染太子参的TuMV的种群多样性与地域没有明显相关性。根据系统进化树，可以看出TuMV太子参分离物与日本的芜菁Brassica rapa上的C42J分离物、野甘蓝B.oleracea上的Tu3和KWB778J分离物、浙江的芸苔B.campestris上的CHZJ26A分离物亲缘关系较近（图2）。

2.3不同产地太子参BBWV2 CP基因克隆及系统进化树分析

结合RTPCR检测结果，选择7个BBWV2阳性样品进行CP基因的序列及系统进化树分析，7个样品分别为福建省的GX2、HB1和BL1，贵州省的DZ24和CG5，安徽省的XC2和XC4。使用BBWV2 CP基因全长扩增引物BBWV2CPF和BBWV23464R进行PCR扩增，产物经测序确定均为1 891 bp（图3）。BBWV2 GX2、HB1、BL1、DZ24、CG5、XC2和XC4分离物核苷酸序列均上传至NCBI数据库，GenBank登录号分别为：MW192525、MW192520、MW192521、MW192526、MW192522、MW192524和MW192523。经BLASTn分析，发现上述分离物均与日本辣椒Capsicum annuum上分离到的BBWV2 IP分离物（AB018698）相似性最高，核苷酸序列相似性为93.61%～94.25%，氨基酸序列相似性为97.33%～98.50%。分析发现扩增片段包含完整的LCP基因和SCP基因，预测编码LCP和SCP蛋白分别为402 aa和197 aa，与已报道的BBWV2 CP蛋白序列长度一致。

在NCBI数据库下载了17个BBWV2序列，用于构建系统发育进化树，BBWV1 CP作为远源对照。 系统进化分析显示：本研究获得的7个分离物与已报道的BBWV2太子参分离物BBWVGZ3、BBWVJS1、BBWVSD1、BBWVHN2 和BBWVFJ/ZS11聚为一支。本研究和已报道的12个BBWV2太子参分离物与日本的辣椒上分离到的BBWV2 IP分离物（AB018698）亲缘关系最近，属于Ia亚组。福建的HB1、GX2和安徽的XC4与已报道的贵州BBWVGZ3分离物聚为一支，贵州的DZ24与已报道的江苏BBWVJS1、山东BBWVSD1聚为一支，贵州的 CG5、安徽的XC2与河南BBWVHN2和福建BBWVFJ/ZS11聚为一支，福建的BL1和日本的IP分离物聚为一支（图4），说明侵染太子参的BBWV2的种群多样性与地域没有明显相关性。

2.4不同产地太子参CMV CP基因克隆及系统进化树分析

结合RTPCR检测结果，选择3个CMV阳性样品进行CP基因的序列及系统进化树分析，3个样品分别为福建省的GX6和HB6，安徽省的XC8。使用CMV CP基因的全长扩增引物CMVII931F和CMVII2044R进行PCR扩增，产物经测序确定均为1 112 bp（图5）。CMV GX6、HB6和XC8分离物核苷酸序列均上传至 NCBI数据库，GenBank登录号分别为MW192518、MW192517和MW192519。BLASTn 分析发现，HB6、GX6和XC8分离物分别与我国番茄上的Tsh分离物（DQ249298）、Kin分离物（Z12818）、烟草上的Hnt分离物（KC407999）核苷酸序列相似性最高，核苷酸序列相似性分别为98.02%、98.02%和99.17%，氨基酸序列相似性分别为98.00%、98.17%和100%。使用ORF Finder程序分析发现扩增片段编码完整的CP基因，预测编 码CP蛋白的长度为218 aa，与已报道的CMV CP蛋白序列长度一致。

在NCBI数据库下载了15个与上述CMV分离物相似性较高的序列用于构建系统发育进化树，花生矮化病毒Peanut stunt virus（PSV）的ER株系作为远源对照。系统进化分析显示：所有CMV分离物可分为Ⅰ组和Ⅱ组，Ⅰ组进一步可分成IA亚组和IB亚组。本研究获得的3个CMV分离物属于Ⅱ组，其中，安徽省的XC8分离物与中国的番茄Lycopersicon esculentum上的SL分离物，烟草上的Hnt分离物和韩国甘露子Stachys affinis上的Ack2分离物亲缘关系最近，福建省的HB6和GX6分离物单独聚为一支（图6）。

3讨论

本研究对福建柘荣、贵州施秉县和丹寨县、安徽宣城等太子参产区病毒病发生情况进行了调查，病害样品病毒检出率为91.55%，其中，福建柘荣县和安徽省宣城市的检出率最高（100%），这可能与太子参种苗带毒和田间管理粗放有关。福建省柘荣县采集的32份样品均被TuMV和BBWV2复合侵染，其中5份样品还混合有CMV侵染，安徽省宣城市的13份样品BBWV2、TuMV和CMV的检出率分别为92.31%、46.15%和30.77%，推测该地区太子参病毒病的主要病原为BBWV2。贵州省施秉县和丹寨县的26份样品中，病毒检出率为76.92%，其中，TuMV的检出率最高（69.23%），其次为BBWV2（19.23%），未检测到CMV，推测该地区太子参病毒病的主要病原为TuMV（表2）。贵州省施秉县牛大场镇牛大场村的6个样品表现出疑似病毒症状，但未检测到TuMV、BBWV2、CMV和TMV，不排除被其他病毒侵染的可能，需借助高通量测序技术进一步检测其带毒情况。

本研究明确了TuMV、BBWV2和CMV福建、贵州、安徽分离物的亲缘关系和分类地位。2015年，匡云波等[8 9]曾对福建、江苏、湖南、贵州、山东5省太子参TuMV和BBWV2的序列差异性进行分析，發现TuMV和BBWV2的序列差异具有地域性。本研究对福建、贵州和安徽TuMV和BBWV2 CP基因核苷酸序列差异性进行分析，发现太子参TuMV和BBWV2序列差异不存在地域性，推测序列地域性的消失与种苗跨地域运输有关。

本次调研发现，病毒病已经成为威胁太子参生产的重要病害，亟须有效的防控措施。目前，生物或化学手段对植物病毒病的防治效果有限。因此，控制种苗传毒，切断病毒病传播媒介，仍是当前最为有效的病毒病防控手段。太子参主要通过无性繁殖，期间病毒极易通过种苗进行传播。目前，已建立成熟的太子参脱毒繁育体系[13]。建立全面、高效的病毒检测体系，保证脱毒种苗真正“脱毒”是当下亟待解决的关键问题，这对于太子参优质种苗及优势品种的可持续种植具有重要意义。

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收稿日期：2020 11 02修订日期：2020 12 23

基金项目：

中国医学科学院医学与健康科技创新工程 （2016-I2M-3-017）;中央本级重大增减支项目（2060302）

* 通信作者

Email：wlding@implad.ac.cn