晚期肺腺癌IASLC分级和TTF-1蛋白表达与不同治疗方案疗效和患者预后的相关性

陈君平 程兰兰 王 健 徐 军

尽管基于影像学和病理诊断的TNM分期是目前指导肺癌治疗、判断预后的主要依据，但仍不能精确判断肿瘤的生物学特性及分子水平变化[1]。同一分期接受相同治疗的患者生存个体差异很大，提示存在其他独立于传统TNM分期的影响预后的因素，探寻这些影响化疗及靶向治疗疗效和预后的分子标志物表达特征，有助于更好地开展肺癌的个体化治疗。2021年第5版WHO肺肿瘤组织学分类中新增了IASLC(International Association for the Study of Lung Cancer) 肺腺癌分级系统，与肺癌手术切除后较高的复发率和较短的无病生存期有关[2]。甲状腺转录因子1(thyroid transcription factor 1,TTF-1)是诊断肺腺癌最常用的标志物之一，同时也是早期肺癌手术切除后的预后指标，但对TTF-1与晚期肺癌特别是接受不同治疗方案的疗效判断和预后的关系研究结果并不一致[3，4]。本研究探讨IASLC分级和TTF-1蛋白表达对晚期肺腺癌患者疗效和预后的影响，为临床选择个体化治疗方案提供参考。

对象与方法

1.患者与组织样本：回顾性分析中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院2016年1月～2019年12月连续收治的563例确诊为肺腺癌患者的临床资料，临床分期为ⅢB～Ⅳ期，均接受EGFR、ALK、KRAS基因突变检测，从中选取EGFR敏感突变阳性、ALK和KRAS基因检测阴性、接受表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)一线治疗的患者114例(EGFR 突变组)，EGFR阴性且接受培美曲塞联合铂类药物一线治疗患者119例(EGFR非突变组)。所有入组患者均有完整临床病理资料，包括年龄、性别、吸烟史等，有足够的组织活检标本，随访资料完整。按照IASLC分级系统(2021版)进行组织学分级。本研究通过中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院医学伦理学委员会审批(伦理审批号：202112001)，所有纳入患者均签署知情同意书。

2.基因突变扩增阻滞系统(ARMS法)：人类EGFR基因21种突变检测试剂盒购自厦门艾德生物公司，所有标本均采用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片厚6～8μm，数量≥10张，应用FFPE样品DNA分类试剂盒提取DNA，将提取好的DNA稀释成2ng/μl,按42.3μl稀释好的DNA模板加入2.7μl Taq酶液混合，分别取5μl加入到预先分装好的8联管反应液中，离心后用ABI7500荧光定量PCR仪进行检测，反应条件：95℃预变性5min，95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，共15个循环；93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，共31个循环；后31个循环60℃收集FAM和HEX信号，数据分析。

3.免疫组织化学染色及结果判定：采用免疫组织化学EliVision二步法。兔抗人TTF-1单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司，石蜡切片脱蜡至水，其余均在BenchMark-GX全自动免疫组化仪(德国罗氏公司)上进行，分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。TTF-1阳性定位于细胞核，结果判定参考Zhang 等[5]的方法，以阳性细胞数≥5%为阳性，<5%为阴性。

4.疗效评价及随访预后分析：分为完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partial response, PR)、疾病稳定(stable disease, SD)和疾病进展(progressive disease, PD)。客观缓解率(objective response rate, ORR)=(CR+PR)/全部病例数×100%，疾病控制率(disease control rate, DCR)=(CR+PR+SD)/全部病例数×100%。无进展生存时间(progression-free survival, PFS)的定义为患者从接受治疗开始至疾病进展或疾病尚未进展的末次随访时间。总生存时间(overall survival, OS)的定义为患者从接受治疗开始至死亡或2021年12月31日的时间。随访截止日期为2021年12月31日。

5.统计学方法：应用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计分析，组间比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验,计算患者的PFS和OS，并绘制生存曲线比较生存率。单因素及多因素分析采用COX比例风险回归分析预后影响因素，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.TTF-1在肺腺癌组织中的表达与临床病理特征的关系：233例初治ⅢB期或Ⅳ期肺腺癌患者基线特征详见表1。其中EGFR敏感突变阳性114例，突变类型为19del 53例，L858R 51例，少见敏感突变10例(8%)，包括G719X突变5例，19del和L858R突变3例，L861Q突变1例，L861Q和S768I突变1例。233例患者中TTF-1阳性191例(82%，图1)，低IASLC组织学分级、EGFR敏感突变、不吸烟患者TTF-1的阳性表达率高于对应组。

图1 TTF-1在晚期肺腺癌中的表达A.肺腺癌IASLC分级Ⅱ级(HE染色,×100)；B.同一例TTF-1阳性(EliVision二步法,×100)；C.肺腺癌IASLC分级Ⅲ级(HE染色,×200)；D.同一例TTF-1阴性(EliVision二步法,×200)

表1 TTF-1在肺腺癌组织中的表达与临床病理特征的关系

2.TTF-1蛋白表达、IASLC分级对患者不同治疗方案近期疗效的影响：EGFR突变组中IASLC分级Ⅲ级患者的ORR明显低于Ⅰ、Ⅱ级患者(P=0.023)，TTF-1阳性患者ORR高于TTF-1阴性患者，但差异无统计学意义(P=0.075)。EGFR非突变组中IASLC分级Ⅲ级患者的ORR亦低于Ⅰ、Ⅱ级患者(P=0.024，表2)。

表2 晚期肺腺癌患者接受不同治疗方案的近期疗效(n)

3.TTF-1蛋白表达和IASLC分级对患者PFS的影响：COX回归结果显示(表3，图2)，在EGFR突变组和非突变组中IASLC分级Ⅲ级、TTF-1阴性患者PFS均短于相应对照组，并且IASLC分级(P=0.008，HR=1.954,95% CI：1.194～3.200)、突变类型(P=0.003，HR=1.711,95% CI：1.207～2.423)是影响EGFR突变组PFS的独立因素； IASLC分级(P=0.002，HR=1.928,95% CI：1.263～2.944)、TTF-1表达(P=0.002，HR=2.211,95% CI：1.342～3.641)是影响EGFR非突变组患者PFS的独立因素。

图2 IASLC分级、TTF-1蛋白表达与晚期肺腺癌患者PFS的关系

表3 影响晚期肺腺癌患者PFS的COX单因素回归分析

4.TTF-1蛋白表达、IASLC分级对患者OS的影响：在EGFR突变组、EGFR非突变组中IASLC分级Ⅲ级、TTF-1阴性患者OS均短于相应对照组(表4，图3)，并且TTF-1表达是影响EGFR突变组(P=0.002，HR=3.727, 95% CI：1.654～8.398)和EGFR非突变组(P=0.005，HR=2.042, 95% CI：1.239～3.365)OS的独立因素。

表4 影响晚期肺腺癌患者OS的COX单因素回归分析

图3 IASLC分级、TTF-1蛋白表达与EGFR突变、无突变患者患者OS的关系

讨 论

TTF-1是一种核转录蛋白，是诊断肺腺癌最常用的标志物之一，同时也是早期肺癌手术切除后的预后指标[3]。文献报道，晚期肺癌中TTF-1的表达与患者的化疗疗效及预后有关，但结果并不一致[4,6～8]。Oktay 等[6]报道200例肺腺癌患者TTF-1表达与OS相关，但该研究入组病例中还包含了25.5%的Ⅰ～ⅢA期患者，部分患者还接受了手术治疗，其TTF-1阳性率为67.5%，明显低于大部分研究报道的阳性率(80%～90%)[9～11]。可能与种族差异导致入组病例中EGFR突变阳性例数太少有关(仅17例)，因为根据以往研究报道和本实验的结果，TTF-1阳性与EGFR突变呈正相关[5,12,13]。

Park等[4]研究发现，EGFR阴性肺癌中TTF-1表达与患者PFS和OS都相关，但TTF-1阳性和阴性组之间对化疗的客观缓解率(ORR)和疾病控制率(DCR)差异无统计学意义，笔者的研究结果与之基本一致。但也有研究报道，培美曲塞联合奈达铂组 TTF-1阳性患者ORR、DCR 均高于TTF-1阴性患者[14]，Misch 等[15]报道，晚期小细胞肺癌TTF-1阳性患者化疗反应率相比阴性者高，TTF-1表达可能预测化疗疗效，TTF-1与肺癌含铂化疗反应率存在联系，TTF-1表达还可以预测免疫检查点抑制剂治疗的疗效[16,17]。Schilsky等[10]研究发现，TTF-1阳性和阴性组使用一线培美曲塞基础方案化疗持续时间无明显差异，但该研究只是用化疗持续时间来评价化疗效果，并未分析TTF-1表达与患者PFS的关系。亦有资料显示，TTF-1阳性者预后相对差[18]。上述分歧提示肺腺癌TTF-1阳性患者在不同化疗方案中疗效及预后存在差异。本研究探讨了TTF-1的表达与晚期肺腺癌患者一线接受培美曲塞基础化疗的疗效和预后的关系，结果显示，TTF-1与患者中位PFS、OS均与TTF-1表达相关，COX回归分析发现TTF-1表达是影响患者OS的独立因素，TTF-1表达缺失提示接受培美曲塞基础化疗的患者预后不良。

关于TTF-1对晚期肺癌特别是有EGFR敏感突变并接受EGFR-TKIs治疗的预后影响研究较少。本研究结果显示EGFR敏感突变肺腺癌中TTF-1阳性率为88.6%，阴性组TTF-1阳性率为75.6%，TTF-1阳性与EGFR突变呈正相关，与文献报道相符[5，12，13]，提示TTF-1的表达可以作为预测患者EGFR突变状态的分子标志物，如果TTF-1阴性，取材标本有限，则可以考虑优先检测EGFR之外的其他分子靶点。Zhang等[5]研究了中国人群大样本资料TTF-1的表达，晚期EGFR突变的肺腺癌中TTF-1的表达与患者PFS相关，但未分析TTF-1的表达与患者接受EGFR-TKIs后OS的关系。本研究结果显示，TTF-1表达与患者PFS和OS均有关，在EGFR突变组中TTF-1阳性患者ORR高于TTF-1阴性患者，但差异无统计学意义(P=0.075)，可能与入组患者例数太少有关(TTF-1阴性者仅13例)，尚需开展大样本量前瞻性随机研究，以明确TTF-1表达对EGFR-TKIs的近、远期疗效预测价值。

本研究结果显示，无论有无EGFR突变，TTF-1蛋白是预测晚期肺腺癌患者PFS和OS的有效指标，能为临床医生在制定个性化的治疗方案时提供参考。TTF-1表达影响患者PFS和OS的具体机制仍未完全明确，TTF-1 在生理状态下参与肺上皮组织发育及分化的调控，同时参与调控肿瘤分化与抑制细胞转移潜能。肺癌患者TTF-1阳性提示肿瘤尚存在一定程度的正常分化能力，细胞分化相对成熟，侵袭力相对弱。肺腺癌中TTF-1表达与细胞增殖指数ki-67呈负相关，而ki-67与化疗患者ORR呈显著负相关[5, 19]。本研究结果亦显示，IASLC组织学分级低肺腺癌TTF-1的阳性表达率高于分级高者，说明细胞分化越差，增殖能力越强，TTF-1越容易出现表达缺失，侵袭能力越强，越能抵抗化疗和EGFR-TKIs，患者预后越差。

2021年第5版WHO胸部肿瘤组织学分类中新增了IASLC肺腺癌分级系统，Ⅰ级以贴壁样为主，<20%高级别模式(实性、微乳头、纤维间质内单个肿瘤细胞浸润)；Ⅱ级以腺泡状、乳头状为主伴<20%高级别模式；Ⅲ级为任何组织类型伴≥20%高级别模式。既往研究发现，肺腺癌的组织类型如实性、微乳头状生长方式与预后差有关，Zhang等[5]研究发现，不同生长模式的EGFR突变的肺腺癌其PFS有差别。Jeon等[2]研究发现，IASLC分级与ⅠA期肺腺癌手术切除的预后有关。Yu等[20]报道高组织学分级肺腺癌患者接受化疗ORR明显低于低分级患者，但研究组选取的是患者的手术切除样本，优点是能准确全面评估癌组织的生长模式，但并不能完全反映患者发生复发或转移时的组织学状态。笔者采用的大多是患者治疗前的肺穿刺样本，结果显示，无论有无EGFR敏感突变，同IASLC分级为Ⅰ、Ⅱ级患者比较，IASLC分级Ⅲ级患者PFS和OS更短，ORR更低，IASLC分级是预测培美曲塞基础化疗和EGFR-TKIs的疗效和预后的简单有用指标。本研究不足之处在于肺腺癌有一定的异质性，穿刺标本组织量少，评价IASLC分级有一定的局限性。