基于TNF家族基因的肝癌分型及预后模型的建立

吴白骏 刘 恬 胡朝全

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原发性肝癌最常见的病理类型，是一种恶性程度高、复发率高、预后差以及具有难治性的异质性疾病[1]。据报道2020 年原发性肝癌在全球癌症发生率中排名第6位，病死率排名第3位[2]。由于大部分肝癌患者诊断即为晚期，因此很多人都失去了手术机会[3]。此外，索拉非尼等抗血管生成药物临床耐药现象严重，需要寻找新疗法突破肝癌治疗瓶颈，实施个体化治疗[4]。异常免疫微环境驱动了肝癌发生、发展，因此免疫检查点阻滞剂的使用在肝癌治疗中发挥重要的作用[5]。近年来，贝伐单抗联合阿特利珠单抗的成功应用给难治性肝癌患者带来了希望，标志着肝癌一线治疗的变化[6]。目前，临床报道只有少数肝癌患者能够获益于免疫检查点抑制剂[7]。因此需要寻找能够获益于免疫治疗的肝癌患者进行风险分层，进而对患者的免疫治疗进行疗效预测。

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)和肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族由19个配体和29个受体组成，大部分成员已经被报道过与癌症发生、发展相关[8]。TNF家族基因在细胞功能调节和免疫细胞的增殖与分化方面发挥重要作用，能够通过共抑制或共刺激方式作用于免疫系统[9]。因此，TNF家族基因的表达情况可能与肿瘤免疫治疗有一定的相关性。然而，TNF家族成员在肝癌中的表达模式、免疫学特征和肿瘤微环境的研究较少，其功能有待于进一步研究。

本研究评估了肝癌中TNF家族基因的肿瘤免疫微环境特征，并基于TNF家族基因的表达，通过无监督聚类分型对肝癌患者进行风险分层以识别能够获益于免疫治疗的患者。并进一步分析了两型患者的肿瘤突变负荷和免疫特征如免疫细胞浸润能力、对免疫治疗的反应等。此外，笔者基于两型的差异基因构建了预测性能较好的风险评分模型，该模型对评估肝癌患者的预后具有一定的意义。

材料与方法

1.数据来源:肝癌转录组和临床资料等公共数据主要下载自UCSC上的TCGA TARGET GTEx数据集，其中包括了371例肝癌样本(命名为TCGA-LIHC数据集)与160例正常肝组织样本。验证集ICGC-LIRI-JP肝癌数据主要下载自HCCDB数据库，其中包括212例肝癌样本。

2.基于TNF家族基因的无监督聚类分型:基于定义明确的47种TNF基因的表达量，利用“ConsensuClusterPlus”R包中的k-means算法对TCGA-LIHC数据集的肝癌患者进行无监督聚类分型[10]。主成分分析(principal component analysis, PCA)对数据进行降维处理以鉴定了TNF基因对新分型的区分能力。本研究肝癌新分型是指基于TNF家族基因的表达情况对肝癌患者进行聚类，分为了TNF家族基因表达水平较高的TNF-A型与表达水平较低的TNF-B型。既往报道了TNF家族基因高表达与较高的免疫浸润水平和较好的免疫治疗反应相关。

3.免疫细胞浸润评分:从TISIDB数据库中下载28种免疫细胞各自的基因集，利用“GSVA”R包中的单样本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)评估TCGA-LIHC数据集中每个患者免疫细胞浸润评分[11]。并且利用Spearman相关性分析分析TNF家族基因的表达量与免疫细胞浸润程度的相关性。

4.新分型的肿瘤突变负荷:从TCGA数据库中下载肝癌患者的突变数据，得到肝癌基因突变频率，利用“waterfalls”R包将结果以瀑布图显示。同时应用“maftools”R包评估每个患者的肿瘤突变负荷(tumor mutational burden, TMB)。TCGA-LIHC数据集中每个肝癌患者是否发生TP53、CTNNB1和TTN的突变数据下载自cBioPortal数据库。

5.免疫逃逸与免疫反应:肿瘤免疫功能障碍和排斥(tumor immune dysfunction and exclusion, TIDE)评分是2018年报道的一种新型的、能够较好预测免疫逃逸能力和对免疫治疗反应的一种评分系统，其中，TIDE分值越高提示发生免疫逃逸的可能性越大，免疫治疗效果越差[12]。将TCGA-LIHC肝癌数据集的mRNA表达矩阵输入到TIDE官网中可以得到每例肝癌患者的TIDE得分和对免疫治疗的反应能力。

6.风险模型的建立:应用“edgeR”R包对TNF-A型与TNF-B型的两组患者进行差异基因分析，差异基因的显著性标准为|log2(差异倍数)|>1，P<0.05。接下来利用COX单因素回归分析得到差异基因中与预后显著相关的基因，并应用LASSO回归分析(“glmnet”R包)缩小基因范围，得到构建风险模型的基因相关系数，风险评分(risk score)计算公式：Risk score=∑βi×expi。其中，βi代表基因的系数，expi代表基因的mRNA表达量。以风险得分的中位数为阈值将患者分为高风险组和低风险组。

7.生存分析：Kaplan-Meier生存曲线利用“survival”和“survminer”R包中的Log-rank检验，并且利用“timeROC”R包评估风险评分模型的预测准确性。

8.统计学方法:应用 R 3.6.2统计学软件对数据进行统计分析与绘图。两组间的比较采用Wilcoxon秩和检验进行统计分析，生存曲线的组间差异采用Log-rank检验。采用单因素COX回归分析计算风险比(hazard ratio, HR)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.TNF家族在肝癌中的免疫特征:为了评估TNF家族基因在肝癌中的表达水平，箱线图(图1A)表明47种TNF家族基因中大部分基因mRNA水平在癌组织中高于正常组织。进一步分析在肝癌中TNF家族基因分别与28种免疫细胞的相关性，发现大部分TNF基因与28种免疫细胞呈正相关(图1B)。

图1 TNF家族在肝癌中的表达水平及免疫特征A.TNF家族基因在肝癌与癌旁的mRNA表达水平;B.TNF家族基因与28种免疫细胞的相关性

2.基于TNF家族基因构建肝癌新分型:接下来，基于肝癌中TNF基因的表达量进行无监督聚类分析，对TCGA-LIHC肝癌患者进行分型，发现分为两型时效果最好，命名为TNF-免疫分型包括TNF-A型和TNF-B型(图2A)。PCA发现新分型能够将TCGA-LIHC患者较好的分开(图2B)。箱线图(图2C)显示，TNF家族基因分别在两分型中的表达量情况，结果提示几乎所有的TNF家族基因在TNF-A型中显著上调。生存分析(图2D)表明TNF-A型与TNF-B型相比具有较长的无进展间期(progression-free interval, PFI)和无病间隔期(disease free interval, DFI)，而总生存期(overall survival, OS)在TNF-A和TNF-B两型中比较，差异无统计学意义。

图2 基于TNF家族基因肝癌新分型的建立A.无监督聚类分型对肝癌进行分型；B.PCA分析；C.两种分型中TNF家族基因的表达量比较(*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001)；D.Kaplan-Meier曲线比较两种分型的预后情况

3.TNF免疫分型中基因突变特征:接下来结合肝癌患者的基因突变特征对TNF肝癌新分型进行更细致的分析，小提琴箱线图(图3A)表明TNF-B型中的TMB明显高于TNF-A型。瀑布图(图3B)显示肝癌患者基因突变频率排名前3位的基因分别是TP53(30%)、CTNNB1(25%)和TTN(24%)。进一步分析，堆积图表明TNF-B型具有较高的CTNNB1和TTN突变可能，而TP53突变在两型中差异无统计学意义(图3C)。患者较高的基因突变常提示预后不良，这与TNF-A型的预后优于TNF-B型的结果相一致。

图3 TNF免疫分型中基因突变特征A.比较两型的肿瘤突变负荷；B.肝癌中基因突变频率排名；C.比较两型中TP53、CTNNB1和TNN基因突变比例

4.TNF免疫分型的免疫特征:TNF家族基因在免疫过程中发挥重要的作用，接下来，用ssGSEA算法评估28种免疫细胞在肿瘤微环境中的浸润程度，小提琴箱线图(图4A)表明，TNF-A型的免疫细胞浸润程度较高，包括活化的CD4 T细胞、活化的CD8 T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell, NK cell)等。其中，生存分析(图4B)发现，活化的CD8 T细胞和效应记忆CD8 T细胞浸润程度越高的患者预后越好，这与TNF-A型患者预后优于TNF-B型相一致。考虑到免疫检查点分子的表达与免疫反应相关，进一步分析发现，PD-1、PD-L1、LAG3和CTLA4在TNF-A型的mRNA表达水平均显著升高(图4C)。堆积图提示在TNF-A型中患者对免疫治疗反应率高于TNF-B型(图4D)。箱线图(图4E)提示TNF-A型中患者TIDE得分值低于TNF-B型。以上分析均提示TNF-A型的患者可能对免疫治疗较敏感。

图4 TNF免疫分型的免疫特征A.两型之间免疫细胞浸润程度的比较；B.免疫细胞的生存分析；C.两种亚型之间免疫检查点分子表达量的比较；D.两种亚型之间对免疫治疗反应与不反应患者所占的比例；E.两种亚型之间TIDE得分的比较

5.风险评分的构建及其临床价值:为了对TNF家族基因在肝癌中的作用进行个性化评估，笔者基于TNF免疫分型进一步构建了风险评分系统。首先，对TNF-A型与TNF-B型患者进行差异分析，发现在TNF-A型中有866个上调的基因与167个下调的基因(图5A)。根据差异倍数进行排序，筛选出上调基因中排序前100的基因和下调基因中排序前100的基因进行COX与LASSO回归分析。COX单因素回归分析联合LASSO回归分析缩小基因范围，筛选出有14个基因(图5B)被纳入风险评分模型。森林图(图5C)显示构建风险评分的14个基因的预后价值，HR>1表明该基因为风险因子，否则为保护因子。生存分析提示高风险组较低分险组的患者预后不良，且差异有统计学意义(图5D)。其中，1年、3年和4年患者总生存期的受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线的曲线下面积(area under the curve, AUC)分别为0.758、0.789 和 0.768，证明预测模型较为准确(图5E)。接下来，利用ICGC-JP数据集进行外部验证，发现风险得分较高的分组其预后也显著较差(图5F)，且1年、3年和4年ROC的AUC分别为0.674、0.713和0.710，也证明了预测模型较好(图5G)。热图(图5H)表明，较高的G分级、M转移、N转移、T分期与TNM分期出现在高风险组中，且T分期与TNM分期差异有统计学意义。

图5 风险评分的构建和临床价值的评估A.TNF-A型与TNF-B型的差异分析；B.LASSO回归分析得到构建风险评分的基因；C.构建风险评分的基因的风险比；D.高低风险组的生存分析；E.风险评分模型的ROC曲线；F.ICGC-JP验证集中高低分险组的生存分析；G.ICGC-JP验证集的ROC曲线；H.TCGA-LIHC数据集中高低风险组临床病理特征的评估(*P<0.001)

讨 论

肝癌是一种异质性的疾病，该疾病的主要风险因素包括病毒感染(乙型病毒性肝炎为主)，非酒精性脂肪性肝病和糖尿病等[13]。由于大部分肝癌患者术后易复发，并且抗血管生成药物的耐药现象严重，因此免疫治疗在肝癌治疗中发挥越来越重要的作用[14]。但由于只有少部分肝癌患者能够获益于免疫治疗，因此亟需构建肝癌新分型以筛选免疫治疗获益人群，实施个体化治疗。本研究是首次基于TNF家族基因对肝癌患者进行分型，比较两个分型的肿瘤突变特征和免疫学特征，并进一步构建风险评分模型以寻找新型生物学标志物预测患者的预后。

TNF家族已经被报道能够通过增加TNFR超家族成员信号以增强肿瘤的免疫反应或者药物通过结合TNF家族成员直接杀死肿瘤[15]。本研究比较了47种TNF家族基因在肝癌与癌旁组织的mRNA表达数据，发现大部分基因在肝癌中显著上调。进一步分析发现TNF家族基因与免疫细胞浸润大部分呈正相关，这些结果均表明肝癌中TNF基因可能影响免疫特征。

目前，已经报道的肝癌分型有G1～G6分型、S1～S3分型和iC1～iC3分型等[16～18]。但是没有报道过基于TNF表达模式建立的肝癌分型，且报道的能够用来区分对免疫治疗是否敏感的分型较少[19]。因此，笔者以TNF表达量为依据，采用无监督聚类的方式将TCGA-LIHC患者分为两种具有不同免疫特征及肿瘤突变特征的分型，其中，TNF-A型预后好。基因突变促进了肿瘤的发生、发展，已有研究报道TP53突变、CTNNB1突变或TTN突变驱动肝癌的发生、发展且往往预示患者预后差[20～22]。本研究亦发现，TNF-B型的CTNNB1突变和TTN突变较高且预后差。

肿瘤细胞与肿瘤微环境内免疫细胞的相互调节作用决定了免疫治疗反应，并且TNF家族基因与免疫特征相关，因此本研究进一步分析比较了TNF-A型与TNF-B型的免疫特征以寻找能够获益于免疫治疗的人群[23]。近年来有研究报道，在肝癌中免疫细胞浸润程度高(例如B淋巴细胞浸润)被确定为独立的积极预后因素[24]。免疫检查点分子(PD-1、PD-L1、LAG3和CTLA4)已被确定为免疫反应的关键调节因子，其表达模式与治疗反应密切相关，为药物的选择提供了有效的指导[25]。本研究发现，TNF-A型的免疫细胞浸润程度强、免疫检查点分子的表达高、免疫逃逸能力弱和对免疫治疗敏感，这与TNF-A型预后较好相符合，而且TNF-B型中CTNNB1突变频率高，高CTNNB1突变促进了免疫逃逸以及对免疫治疗反应弱[26]。以上结果均提示TNF-A型是一种“热”肿瘤，对免疫治疗敏感。

考虑到本研究的临床意义，笔者利用TNF-A型与TNF-B型的差异基因构建风险评分模型以筛选新型生物学标志物评估肝癌患者的风险。风险评分高的患者往往预后不良。此外，该模型也能用来评估患者的临床特征，风险评分较高的患者具有较高的T分期和TNM分期。

综述所述，本研究基于TNF家族基因建立肝癌TNF免疫新分型，能够用来区分患者的免疫特征以及对免疫治疗的反应。并进一步构建风险评分模型，识别新型生物学标志物以预测肝癌患者的预后及临床病理特征，但具体的作用机制还需要开展进一步研究。