细胞遗传学检测方法对MLL基因异常儿童急性白血病的诊断意义

孙恒娟， 杜成坎， 李 红， 柳 敏， 张 泓

（1.上海市儿童医院 上海交通大学医学院附属儿童医院检验科，上海 200040；2.上海市儿童医院 上海交通大学医学院附属儿童医院血液科，上海 200040）

急性白血病（acute leukemia，AL）是儿童常见恶性疾病，约占15岁以下儿童恶性肿瘤的25～30%。AL患儿各种基因重排较普遍，混合谱系白血病（mixed linage leukemia，MLL）基因重排是其中之一，MLL基因又称KMT2A、ALL1或HRX基因，位于11号染色体长臂2区3带（11q23），可见于15.0%～20.0%的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）和2.5%～5.0%的急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患儿，在婴幼儿AL中占75%[1]。伴MLL基因重排的AL大多恶性程度高，缓解率低，对化疗不敏感，患儿预后不佳，是AL的一种独特亚型。本研究对MLL基因异常的AL患儿进行细胞遗传学分析，比较常规细胞遗传学（conventional cytogenetics，CC）检测方法（染色体G显带）和荧光原位杂交（ fluorescence in situ hybridization，FISH）技术诊断MLL基因异常、MLL基因重排、染色体11q23异常AL患儿的临床价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016年6月—2021年6月上海市儿童医院收治的初发AL患儿404例，其中男228例、女176例，年龄2个月～15岁。根据《血液病诊断及疗效标准》[2]，确诊ALL患儿308例、急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患儿96例。

1.2 仪器和试剂

Chang Medium MF/BMC细胞培养试剂（美国Irvine Scientific公司）、Sigma-AlorichGs500染液（美国Sigma-Alorich公司）、VysisFISH探针（美国Abbot公司）、BX51和BX61显微镜（日本Olympus公司）、CDS5细胞生成干燥箱（美国Thermotron公司）、Thermobrite杂交仪（美国Leica公司）。

1.3 CC法染色体核型分析

采用24 h和48 h培养法制备染色体样本，根据人类细胞基因组学国际命名体系（2016）描述染色体核型。严格按照试剂盒和仪器说明书要求进行检测。

1.4 FISH技术分析

采用直接法获取细胞，采用双色分离探针变性、杂交过夜后，用6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，4'，DAPI）复染细胞核。使用荧光显微镜在DAPI/FITC/Texas Red三色滤光镜下观察间期荧光杂交信号，以红绿黄色（1R1G1F）荧光信号为MLL基因重排阳性。每例至少分析300个间期细胞，不计重叠细胞，计算阳性细胞比例。严格按照试剂盒和仪器说明书要求操作。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析，计数资料以例或率表示，比较采用χ2检验。以P＜0.001为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿一般资料

采用FISH技术检出MLL基因异常（重排阳性）患儿57例（14.1%），其中男34例、女23例，年龄2个月～14岁；57例患儿中， ALL患儿40例，其中≤12个月患儿5例（ 12.5%）；AML患儿17例，其中≤12个月患儿4例（ 23.5%）；有10例患儿初发时白细胞计数≥ 50×109/L ，其中ALL患儿7例（ 17.5%）、 AML患儿3例（ 17.6%）。CC法检出MLL基因异常患儿27例（6.7%）。2种方法MLL基因异常检出率差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.2 CC法染色体核型分析结果

40例ALL患儿中，染色体核型正常16例，因培养细胞生长不良不能分析1例，非染色体11q23异常8例，染色体11q23异常15例。15例染色体11q23异常患儿中，单纯数目异常（-11）1例，add(11)(q23)1例，明确MLL基因重排伙伴基因13例[t(4;11)(q21;q23)结构和数目异常7例、t(9;11)(p22;q23)4例、t(1;11)(p32;q23)1例、t(10;11)(p12;q23)1例]。见图1。

17例AML患儿中，染色体核型正常3例，因培养细胞生长不良不能分析1例，非染色体11q23异常1例，染色体11q23异常12例。12例染色体11q23异常患儿中，add(11)(q23)1例，明确MLL基因重排伙伴基因11例[t(9;11)(p22;q23)3例（其中1例增加了1条8号染色体）、t(11;19)(q23;p13)3例（其中1例增加了1条8号染色体）、t(1;11)(q21;q23)3例、t(11;17)(p23;q25)1例、ins(11;11)1例]。见图1。

图1 异常染色体核型

2.3 FISH技术检测结果

57例MLL基因重排阳性患儿均发现MLL基因探针信号异常。40例ALL患儿中，探针信号分离（1F1R1G）MLL基因重排17例，探针信号缺失（1F）8例，探针信号增加15例（13例3F，2例4F）；17例AML患儿中，探针信号分离（1F1R1G）MLL基因重排15例，探针信号增加（3F）2例。见图2。

图2 AL患儿MLL基因FISH技术检测结果

3 讨论

1979年，VAN DEN BERGHE等[3]首先报道了AML中存在11q23染色体异常，此后相关研究在多种血液系统恶肿瘤中发现存在11q23/MLL异常。MLL基因重排是造血系统恶性肿瘤常见的遗传学改变，其易位形成的MLL融合蛋白可引起转录调控异常，诱导HOX、EPHA7、MEIS、PBX等下游目的基因异常表达，影响造血分化，导致白血病的发生[4]。MLL的伙伴基因有80多个，可以导致130余种不同的重排[5]，是此类白血病诊断和预后判断的重要因素。

本研究404例AL患儿中，采用FISH技术检出MLL基因异常57例，其中ALL患儿40例、AML患儿17例。40例ALL患儿中，MLL基因信号拷贝数异常23例，包括信号缺失8例、3拷贝13例、4拷贝2例；探针信号分离MLL基因重排17例，信号模式均为1R1G1F。17例AML患儿中，探针MLL基因信号3拷贝2例；探针信号分离MLL基因重排15例，其中典型异常信号（1R1G1F）10例，1G1F伴MLL基因3'端丢失、1G1F伴额外获得1拷贝MLL基因3'端、2R1G1F伴额外获得1拷贝MLL基因3'端、1R2F伴额外获得1拷贝MLL基因、1G3F伴额外获得1拷贝MLL基因5'端各1例，且这5例患儿探针均有MLL基因重排的现象，这种异常信号的复杂多样化也可能是AML的不良预后因素之一。

本研究结果显示，404例AL患儿中，FISH技术检出MLL基因重排32例（7.9%）、CC法检出24例（5.9%），与相关文献MLL基因重排见于5%～10%的AL患儿结果一致[6]。染色体核型分析检出的染色体11q23畸变包括易位、缺失、重复、插入，本研究明确11q23易位伙伴24例，以t（4；11）、t（9；11）、t（1；11）、t（11；19）染色体易位为主；t（4；11）、t（1；11）（p32；q23）、t（10；11） 均在ALL患儿中被检出；t（1；11）（q21；q23）、t（11；19）、t（11；17）、ins（11；11）均在AML患儿中被检出；t（9；11）、add（11）在ALL和AML患儿中均有检出。非11q23克隆性染色体异常9例、正常核型19例、因培养细胞生长不良不能分析2例。ALL患儿共检出染色体11q23异常15例，其中14例可以明确易位伙伴；1例数目异常，非11q23异常8例，1例因培养细胞生长不良不能分析，核型正常16例。AML检出染色体11q23异常12例，均为结构异常，非11q23其他克隆性染色体异常1例，1例因培养细胞生长不良不能分析，染色体核型正常3例。15例ALL异常中，明确MLL基因重排和伙伴基因13例，其中t（4；11）7例、t（9；11）4例、t（10；11）1例、t（1；11）（p32；q23）1例。AML患儿共检出染色体异常12例，明确MLL基因重排和伙伴基因11例，t（9；11）3例、t（1；11）（q21；q23）3例、t（11；19）3例，t（11；17）1例、ins（11；11）1例，在11q23/MLL基因重排患儿中有2例合并+8，与文献报道的数目异常以三体8多见一致[7]。

综上所述，FISH技术对MLL基因异常检出率高于CC法，且检测周期短、准确性高、敏感性强，但只能针对怀疑片段进行检测，有一定的局限性；CC法是最基本的检测方法，可以直观地呈现MLL基因重排异常类型，并明确其伙伴基因，但不易发现MLL基因隐匿易位，有漏检的可能。2种方法可优势互补，在MLL基因异常AL的诊断中均有较大的价值。