育龄期滴虫性阴道炎患者阴道微生物群分布

范 瑾， 乔 昀， 程 斌

（1.上海中医药大学附属曙光医院检验科，上海 200021；2.上海市浦东新区人民医院检验科，上海 201266）

目前，临床对由阴道毛滴虫引起的滴虫性阴道炎（trichomonal vaginitis，TV）已有有效的治疗方法，但若治疗不彻底，极易复发[1]，严重影响女性身心健康。TV与胎膜早破、不孕等不良围产结局有关[2-3]，早期有效、彻底地进行治疗有较大的临床意义。本研究拟通过了解已婚育龄TV患者阴道内微生物群组成特征，为TV的临床诊治和预防复发提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2017年5月—2021年3月在上海中医药大学附属曙光医院诊治的TV患者54例（TV组）。TV诊断标准：阴道分泌物0.9% NaCl溶液悬滴液可见活滴虫，伴或不伴相应外阴瘙痒、阴道分泌物增多且有异味、下腹痛等临床症状[3]。纳入标准：（1）＜45岁，平时月经正常，未妊娠；（2）阴道无出血，3 d内无性生活、阴道局部用药或阴道操作者；（3）2周内未使用抗菌药物；（4）自愿参加本研究，并签署知情同意书。排除标准：（1）患自身免疫性疾病等系统性疾病；（2）3个月内口服避孕药等性激素；（3）临床资料不全。54例患者中，卵泡期42例、黄体期12例；阴道分泌物清洁度Ⅲ度39例、Ⅳ度15例。另选取同期体检健康女性64例（健康对照组），年龄27～44岁，平素月经正常，无阴道炎症表现；其中卵泡期48例、黄体期16例；阴道分泌物清洁度Ⅰ度56例、Ⅱ度8例；排除外阴阴道滴虫、念珠菌病患者。本研究经上海中医药大学附属曙光医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 妇科常规检查 对所有研究对象进行妇科常规检查，用无菌棉签采集其阴道上1/3处分泌物，稀释后匀涂抹于洁净的载玻片上，制成阴道分泌物湿片和悬滴片，镜下观察是否存在滴虫、阴道加德纳菌、霉菌、念珠菌，并观察细胞形态、线索细胞情况，观察病原菌形态和活动情况，评估白带清洁度。阴道分泌物（白带）清洁度评估标准：微生物以阴道杆菌为主，镜下可见大量上皮细胞，判定为Ⅰ度；镜下出现部分阴道杆菌和上皮细胞，判定为Ⅱ度；镜下脓细胞和杂菌数量多，阴道杆菌和上皮细胞量稀少，判定为Ⅲ度；镜下几乎全为脓细胞和大量杂菌，无阴道杆菌，判定为Ⅳ度。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） 收集所有研究对象阴道拭子，采用SYBER Green I Premix Ex Taq Ⅱ荧光定量检测试剂盒（货号DRR081A，北京赛百盛公司）提取基因组DNA，-70 ℃冷冻保存。以细菌的保守通用区序列设计引物作为样本的内参[4]（由上海英俊生物公司合成），参照文献[4]报道的21种阴道常见细菌的特异引物序列合成特异性引物，采用美国ABI公司7500 Fast仪进行RT-qPCR扩增，严格按说明书要求进行操作。

1.2.3 菌群密集度分级 菌群密集度主要通过细菌分布和排列情况直接判断并分级[5]。将所有研究对象阴道分泌物样本均匀涂片并革兰染色，于100倍油镜下观察30个视野，每个视野细菌平均数为 1～9判定为1级，10～99判定为2级，≥100判定为3级，细菌密集成团等无法计算判定为4级。

1.3 统计学方法

采用Metastats 16.0软件进行统计分析，采用Graph Prism 9.0软件作图。对所有阴道分泌物样本中细菌的丰度进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TV组和健康对照组阴道分泌物革兰染色结果

TV组阴道分泌物中的优势菌为革兰阴性短杆菌，密集度为Ⅲ级；健康对照组阴道分泌物中的优势菌为革兰阳性乳杆菌，密集度为Ⅱ级。见图1。

图1 TV组和健康对照组革兰染色结果（×100）

2.2 TV组和健康对照组阴道分泌物微生物组成

21种常见微生物分析结果显示，64名健康对照者阴道分泌物中的微生物主要为Lactobacillus iners、Lactobacillus crispatus、Gardnerella vaginalis，其中16名优势菌为Lactobacillus iners，24名优势菌为Lactobacillus iners和Lactobacillus crispatus，18名优势菌为Lactobacillus crispatus，以Gardnerella vaginalis厌氧性型为优势菌的6名（B2、B18）。除Gardnerella vaginalis外，B18还存在组成表现为多样化的其他菌群，如Bacterial Vaginosis-Associated Bacteria（BVABla、BVAB2a、BVAB3a）；见图2。54例TV患者阴道分泌物微生物主要为Lactobacillus iners、Prevotella、Leptotrichia amnionii、Sneathia sanguinegens，其中以Lactobacillus iners为优势菌的有4例（A13、A14），以Prevotella为优势菌的有25例，以Leptotrichia amnionii为优势菌的有17例，以Sneathia sanguinegens为优势菌的有8例；见图2。Metastats比较结果显示，2个组阴道分泌物21种常见微生物组成差异有统计学意义（P＜0.05）；PCA结果显示，2个组21种细菌的丰度差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 2个组阴道分泌物微生物组成情况

3 讨论

TV是全球范围内最普遍的寄生虫所致妇科炎症性疾病，有研究结果显示，女性孕期发生TV会明显增加早产、胎膜早破、分娩低体质量儿、新生儿智力残疾等不良妊娠结局的发生率，且滴虫感染与宫颈癌也存在一定关联[6]。世界卫生组织统计数据显示，全球每年新增TV患者约1.7亿例，其中北美地区人群感染率高达60%，为高发区，主要通过性传播感染；因不能较好地认知后遗症和经济条件限制，TV易被患者忽视，通常发展中国家贫困地区妇女发病率高，发达国家发病率低；毛滴虫感染与患者性别、年龄、种族息息相关，以女性为主，同时有多个性伴侣、吸毒、淋球菌感染等也是TV的危险因素[7-8]。育龄期女性体内激素水平适宜滴虫生存，且处于性活跃期，较易发生毛滴虫感染。有研究发现，配偶感染是毛滴虫感染最主要的感染因素，提示性生活的间接或直接接触是已婚育龄女性不可忽视的感染途径[10]。另外，发生TV的育龄期女性也易合并单纯疱疹病毒、支原体、梅毒等其他性传播疾病。因此，早诊断、早治疗TV非常重要。

目前，临床诊断毛滴虫感染一般采用传统的湿片法显微镜检查，快捷、经济，检测阴道分泌物标本特异性较高，但敏感性仅为60%～70%[3]；检测男性样本的敏感性更低。培养法作为诊断的金标准，耗时较长，一般需2～7 d才能出具报告，且培养法易受培养基、标本质量、镜检者技术水平影响。RT-qPCR可以明显提高TV诊断的敏感性、特异性[10-11]。TV患者阴道内微生物种类繁多，相互共生与拮抗，若受到外界毛滴虫入侵，内环境发生变化，会有利于毛滴虫进一步在宿主机体内寄生和侵袭，导致阴道内环境的糖原被阴道毛滴虫大量分解吸收，引起阴道物质组成部分缺失，菌群稳态失衡[12]。有研究发现，TV患者的阴道分泌物涂片中乳杆菌数量明显减少，其他菌成为优势菌[13-14]。另有研究发现，健康女性阴道微生态主要由乳酸杆菌、棒状杆菌、表皮葡萄球菌、阴道加德纳菌等多种菌属组成，其中乳酸杆菌所占比例最高；而部分阴道菌群失调者优势乳酸杆菌所占比例下降，阴道加德纳菌和其他厌氧菌所占比例增加，最终引发细菌性阴道病，并诱发各类临床症状[15]。本研究结果显示，TV患者阴道分泌物主要是革兰阴性短杆菌，密集度为Ⅲ级，而健康对照者阴道分泌物主要以革兰阳性乳杆菌为优势菌，密集度为Ⅱ级，与相关研究结果[16]一致。本研究中，64名健康对照者阴道分泌物微生物组成主要为Lactobacillus iners、Actobacillus crispatus和Gardnerella vaginalis，而54例TV患者阴道分泌物微生物组成主要为Lactobacillus iners、Prevotella、Leptotrichia amnionii和Sneathia sanguinegens。Metastats比较结果显示，2个组阴道分泌物21种常见微生物组成差异和丰度差异均有统计学意义（P＜0.05），提示TV患者的阴道分泌物微生物组成与健康对照者存在明显差异，TV患者阴道中厌氧性Prevotella和Leptotrichia amnionii菌群与健康对照者检出率有明显差异，与相关研究结果[17]一致。

综上所述，分析育龄期TV患者的阴道微生物群组成和感染状况，可为临床TV对症治疗提供参考，有利于改善TV患者阴道内环境。