氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺复配对枸杞根腐病菌的毒力增效作用

张 恒，何 静*，张小彦，张树衡，李彦湘，张金花，程 永，李红磊

(1.甘肃农业大学 林学院，甘肃 兰州 730070；2.先正达(中国)投资有限公司，上海 200120)

枸杞(Lyciumbarbarum)为茄科多年生灌木，是食品与中药制剂的常用原料，有治疗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、抗炎、护肝等多种功效[1-5]。枸杞不仅具有较高经济效益，因其可在重盐碱地和干旱地区生存，也是优良的生态修复树种[6-7]，目前，已在宁夏、甘肃、青海和新疆等多个省份大面积种植[8]。然而，随着枸杞栽培面积的不断增加，枸杞病虫害的发生率也逐年攀升，其中以枸杞根腐病的发生与危害程度最为突出。

枸杞根腐病作为一种土传病害，已在我国各大枸杞产区发生[9]，主要危害栽培枸杞的根部或根茎部，常造成枸杞产量和品质下降，甚至导致树木死亡，严重影响了枸杞的经济效益与生态效益。因环境差异，各地区枸杞根腐病的主要病原菌不尽一致[10-11]，经鉴定甘肃省枸杞根腐病的主要病原菌为腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)[12]。目前，防治枸杞根腐病的主要途径有生物防治和化学防治等。化学防治具有见效快和施用便捷等特点，在枸杞根腐病的防治过程中发挥了重要作用，有效地预防了枸杞根腐病的蔓延和加重。目前生产上用于枸杞根腐病防治的化学药剂主要以多菌灵和甲基托布津等苯并咪唑类杀菌剂为主[13]，但因其作用位点单一，可预期产生抗药性的风险较高[14]。因此，研究筛选防治枸杞根腐病的高效低毒杀菌剂并通过复配实现增效作用，不但可以降低抗药性的风险，还可扩大防治谱，增强药效，减少防治成本。

氟唑菌酰羟胺(pydiflumetofen)是由先正达公司研发的新型吡啶酰胺类杀菌剂，主要作用于琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)，通过干扰呼吸电子传递链复合体Ⅱ上的三羧酸循环来抑制线粒体的功能，阻止其产生能量，抑制病原菌生长，最终导致其死亡，已有报道称氟唑菌酰羟胺对镰刀菌有抑制作用[15]。咪鲜胺(prochloraz)为甾醇合成抑制剂类杀菌剂，主要影响甾醇的生物合成，使菌体细胞功能受到破坏，达到抑菌效果。已有研究发现咪鲜胺对腐皮镰刀菌具有较好的抑菌效果[16-19]。由于咪鲜胺在土壤中的半衰期长、持效性好，因此长期处于含有一定质量浓度咪鲜胺的土壤中的病原菌存在一定抗药性风险[20]。本研究测试了氟唑菌酰羟胺、咪鲜胺复配剂对腐皮镰刀菌的室内毒力，旨在探明上述2种作用机制不同的药剂对腐皮镰刀菌的抑制效果，筛选最佳复配比例，为研究开发新的枸杞根腐病防治制剂、降低抗药性风险提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌种 来自甘肃农业大学森保实验室保存的腐皮镰刀菌，分离自枸杞根腐病病株，试验前经活化处理。

1.1.2 供试药剂 99.7%氟唑菌酰羟胺TC，瑞士先正达作物保护有限公司；95.0%咪鲜胺TC，江苏龙灯化学有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 供试药剂对腐皮镰刀菌菌丝的抑制效果 采用生长速率法[21]。将氟唑菌酰羟胺和咪鲜胺分别用丙酮配制成母液，按3∶2、9∶1、10∶1、5∶1、1∶3、2∶1、2∶3、3∶7、3∶1、1∶10、1∶5、8∶2、1∶1、1∶9、1∶2、7∶3、2∶8的有效质量浓度比例进行复配，用无菌水将各供试药剂稀释到所需质量浓度，分别加入灭菌后的PDA培养基中制成最终有效质量浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含药PDA培养基，以含有等量丙酮的PDA培养基为对照，每处理重复3次。各处理与对照的培养基中丙酮含量均为0.16%。将直径为7 mm的菌饼倒置在制作好的PDA平板中央，置于28 ℃、湿度为40%的黑暗条件下培养，待对照菌落生长至平板的80%时，采用十字交叉法测量菌落直径，并按下式计算菌丝生长抑制率。

菌丝生长抑制率=

(1)

以药剂质量浓度的对数值及对应的抑制百分率的几率值作回归分析，得出各处理的抑制率几率值(y)与质量浓度对数(x)之间的毒力回归方程、EC50值和相关系数。

1.2.2 最佳增效配比对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制效果 采用孢子萌发法[22]。将氟唑菌酰羟胺和咪鲜胺分别用丙酮配制成母液，按3∶2的有效质量浓度比例进行复配，用无菌水将各供试药剂稀释到所需质量浓度。腐皮镰刀菌于28 ℃、湿度为40%的黑暗条件下培养7 d后，在无菌环境中，从加入适量无菌水的PDA培养基上刮下菌丝与孢子，过滤后6 000 r·min-1离心，弃去上清液，用PD培养基调制悬浮液，将配置好的药剂与悬浮液各吸取30 μL滴加于试管中摇匀，使其在低倍镜下每视野约20～40个孢子。吸取1滴药剂与悬浮液的混合液倒悬于载玻片上，制成最终有效质量浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含药PD培养基载玻片。以含有等量丙酮的PD培养基载玻片为对照，每处理3个重复。各处理与对照的培养基中丙酮含量均为0.16%。置培养皿内保湿，(26±1) ℃恒温培养6 h后，在低倍镜下随机抽取5个视野，约100个分生孢子，统计孢子萌发情况(以孢子芽管长度大于孢子短半径者视为萌发)，按下式计算孢子萌发相对抑制率。

(2)

孢子萌发相对抑制率=

(3)

以药剂质量浓度的对数值及对应的抑制百分率的机率值作回归分析，得出各处理的抑制率几率值(y)与质量浓度对数(x)之间的毒力回归方程、EC50值和相关系数。

1.2.3 复配增效评价方法 按Wadley法评价氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺复配抑制腐皮镰刀菌菌丝生长与孢子萌发的联合毒力。

Wadley公式：

(4)

(5)

式中：A、B为单剂；a、b为相应单剂在混剂中的比例；ob为实际观察值；th为理论值。

SR>1.5为增效作用；0.5≥SR≤1.5为相加作用；SR<0.5为拮抗作用。

1.2.4 最佳增效配比对腐皮镰刀菌孢子芽管伸长的抑制效果 按照1.2.2方法制备孢子悬浮液，吸取1滴药剂与悬浮液的混合液倒悬于载玻片上，制成最终有效质量浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含药PD培养基载玻片，以含有等量丙酮的PD培养基为对照，置培养皿内保湿，(26±1) ℃恒温培养6 h后，随机抽取20个分生孢子，测量孢子芽管长度，每处理3次重复。按下式计算芽管伸长抑制率。

芽管伸长抑制率=

(6)

1.2.5 最佳增效配比对腐皮镰刀菌产孢量的抑制效果 按照1.2.1方法制备最终有效质量浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含药PDA培养基，以含有等量丙酮的PDA培养基载玻片为对照，将腐皮镰刀菌菌饼接种于含药培养基上，置于28 ℃、湿度为40%的黑暗条件下培养7 d，在无菌环境中，从加入无菌水的PDA培养基上刮下菌丝与孢子，用4层纱布过滤出菌丝后，混匀孢子悬浮液，在血球计数板上统计各处理孢子数量，每处理3次重复。按下式计算产孢量抑制率。

产孢量抑制率=

(7)

1.2.6 最佳增效配比对腐皮镰刀菌菌丝干重的抑制效果 按照1.2.2方法制备孢子悬浮液，吸取30 μL接种于灭菌后的PD培养基中，摇床28 ℃、160 r·min-1培养12 h后，于无菌环境中分别加入各质量浓度处理试剂，使其终有效质量浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1，对照PD培养基中加入等量的丙酮，继续于摇床上培养12 h后，用2层滤纸抽滤出菌丝，50 ℃烘干至恒重后，在电子天平上称量菌丝干重，每处理3次重复。按下式计算菌丝干重抑制率。

菌丝干重抑制率=

(8)

2 结果与分析

2.1 氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺复配对腐皮镰刀菌菌丝生长的联合毒力

由表1可知，氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺单剂的EC50值分别为0.120 8、0.365 8 mg·L-1，表现为咪鲜胺的抑菌效果较好。在复配试验中，不同供试比例的氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺复配均有较强的抑菌效果。全部供试复配比例的EC50值均小于氟唑菌酰羟胺单剂和咪鲜胺单剂处理。

表1 氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺及其复配剂对腐皮镰刀菌菌丝生长的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of pydiflumetofen,prochloraz and their compound on mycelial growth of Fusarium solani

氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺配比为3∶2、9∶1、10∶1、5∶1、1∶3、2∶1、2∶3、3∶7、3∶1、1∶10、1∶5、8∶2、1∶1、1∶9、1∶2、7∶3时的增效系数(SR)均大于1.5，表现为增效作用。在氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺配比为2∶8时的SR值为0.5～1.5，表现为相加作用。氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺各复配比例的增效强弱依次为：3∶2、9∶1、10∶1、5∶1、1∶3、2∶1、2∶3、3∶7、3∶1、1∶10、1∶5、8∶2、1∶1、1∶9、1∶2、7∶3、2∶8。其中，以氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺复配比例在3∶2时的增效作用最大，其SR达到了4.560 0，可作为氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺复配防治枸杞根腐病的最佳配比处理。

2.2 最佳配比对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制效果

由表2可知，氟唑菌酰羟胺单剂和咪鲜胺单剂对腐皮镰刀菌的孢子萌发均具有一定的抑制效果，其EC50值分别为0.116 7 mg·L-1和1 455.784 8 mg·L-1，其中以氟唑菌酰羟胺对腐皮镰刀菌的孢子萌发抑制效果较好。氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺配比为3∶2时的EC50值为0.060 2 mg·L-1，对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制效果优于2种单剂，增效系数(SR)为3.102 9，表现为增效作用。

表2 氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺及其复配剂对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of pydiflumetofen,prochloraz and their compound on spore germination of F.solani

2.3 最佳配比对腐皮镰刀菌芽管伸长的抑制效果

由图1可知，氟唑菌酰羟胺单剂和咪鲜胺单剂的各质量浓度处理对腐皮镰刀菌孢子的芽管伸长均具有一定的抑制效果，其中以氟唑菌酰羟胺对腐皮镰刀菌孢子芽管伸长的抑制效果较好。各处理对腐皮镰刀菌孢子芽管伸长的抑制率均随处理质量浓度增加而升高。复配处理在0.8 mg·L-1质量浓度下对腐皮镰刀菌孢子芽管伸长的抑制率达83.30%，显著高于2种单剂。

2.4 最佳配比对腐皮镰刀菌产孢量的抑制效果

由图2可知，氟唑菌酰羟胺单剂和咪鲜胺单剂的各质量浓度处理对腐皮镰刀菌孢子产孢量均具有一定的抑制效果，以氟唑菌酰羟胺对腐皮镰刀菌孢子产孢量的抑制效果较好。复配处理在0.1 mg·L-1质量浓度处理下，对腐皮镰刀菌产孢量的抑制率显著高于2种单剂处理。在有效质量浓度为0.4 mg·L-1时，复配处理对腐皮镰刀菌产孢量的抑制率达100%。在有效质量浓度为0.8 mg·L-1时，氟唑菌酰羟胺与复配处理对腐皮镰刀菌产孢量的抑制率均达100%。

2.5 最佳配比对腐皮镰刀菌菌丝干重的抑制效果

由图3可知，氟唑菌酰羟胺单剂和咪鲜胺单剂的各质量浓度处理对腐皮镰刀菌菌丝干重均具有一定的抑制效果，其中以氟唑菌酰羟胺单剂处理对腐皮镰刀菌菌丝干重的抑制效果较好。各处理对腐皮镰刀菌孢子菌丝干重的抑制率均随处理质量浓度增加而升高。复配处理在0.8 mg·L-1质量浓度处理下，对腐皮镰刀菌菌丝干重的抑制率达到66.71%，显著高于2种单剂处理。

3 结论与讨论

3.1 结论

选用氟唑菌酰羟胺单剂与咪鲜胺单剂及其二者不同比例的复配处理对枸杞根腐病主要病原菌——腐皮镰刀菌进行了菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长、产孢量、菌丝干重的抑制试验。结果表明：氟唑菌酰羟胺单剂与咪鲜胺单剂及其复配处理对供试腐皮镰刀菌的各生长发育阶段均具有不同程度的抑制作用。在单剂处理中，以咪鲜胺对腐皮镰刀菌的菌丝生长抑制作用较好，以氟唑菌酰羟胺对腐皮镰刀菌孢子萌发、芽管伸长、产孢量、菌丝干重的抑制效果较好。在复配处理中，以氟唑菌酰羟与咪鲜胺配比为3∶2时，对腐皮镰刀菌菌丝生长抑制的增效作用最强，其增效系数SR值达到了4.560 0，可作为氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺复配防治枸杞根腐病的最佳比例。3∶2复配处理对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制有增效作用，其增效系数SR值达到了3.231 1。氟唑菌酰羟胺、咪鲜胺单剂及3∶2复配处理的各质量浓度处理对腐皮镰刀菌产孢量、芽管伸长、菌丝干重均具有一定的抑制效果，在质量浓度为0.8 mg·L-1时，3∶2复配处理对腐皮镰刀菌产孢量的抑制率达100%，对芽管伸长、菌丝干重的抑制率均显著高于2种单剂处理，在低质量浓度下增效作用不显著。该研究结果将为预防腐皮镰刀菌对氟唑菌酰羟胺单剂和咪鲜胺单剂产生耐药性具有重要意义。

3.2 讨论

在单剂处理中，氟唑菌酰羟胺和咪鲜胺在对腐皮镰刀菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用强弱表现并不一致，这可能与二者的作用位点和抑菌机制不同有一定关系。咪鲜胺可抑制菌体麦角甾醇合成，故对消耗能量较小的菌丝生长的抑制作用更为明显[23]，而对孢子萌发没有明显的抑制效果。刘础荣等[24]在筛选防治红枣黑斑病的杀菌剂时发现：以三唑类为代表的麦角甾醇生物抑制剂对病原菌孢子萌发没有明显的抑制效果，这与本研究结果一致。氟唑菌酰羟胺作为吡啶酰胺类杀菌剂，主要抑制菌体的能量代谢，因此，这对需要较大能量的孢子萌发过程影响较大[25]。在质量浓度为0.8 mg·L-1时，3∶2复配处理对腐皮镰刀菌产孢量的抑制率达到了100%，芽管伸长、菌丝干重的抑制效果均显著高于2种单剂处理，在低质量浓度下增效作用不显著，因此复配剂在田间病情严重时适当增加施用质量浓度，增效效果可能更明显。

氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺对枸杞根腐病的防治鲜有报道。本研究中，咪鲜胺作为甾醇生物合成抑制剂(sterol biosynthesis inhibitors,SBIs)中应用最广泛的C-14α-脱甲基化酶抑制剂(C-14-α-demethylation inhibitors,DMIs)，对核桃黑斑病[26]、蓝莓根腐病[27]、水稻恶苗病[28]等多种病害具有防治作用。但有研究表明，一些病原菌已对咪鲜胺产生了一定的抗药性风险。在江苏省部分稻区，田间恶苗病菌对咪鲜胺已有一定的抗药性[29-31]。中国华北地区瓜类尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)在药剂选择压力下也可形成抗咪鲜胺群体，具有抗药性风险[32]。咪鲜胺为甘肃枸杞产区、青海枸杞产区的常用杀菌剂[33]，故降低腐皮镰刀菌对其的抗性风险尤为重要。

在许多情况下，病原菌对SBIs杀菌剂的抗药性机制是由于抗药性突变体能够主动将药物排出体外[34-36]，即药物外排泵基因过表达。本研究选用吡啶酰胺类杀菌剂——氟唑菌酰羟胺作为咪鲜胺的复配制剂，可通过抑制病原菌ATP的产生，发挥其抑制菌体线粒体功能的作用，影响病原菌的能量代谢，限制药剂外排泵对咪鲜胺的主动运输。当咪鲜胺与氟唑菌酰羟胺复配剂被应用于枸杞根腐病的田间防治时，在造成腐皮镰刀菌麦角甾醇被抑制的同时，可能影响线粒体呼吸作用，例如A.Ciriglianoetal[37]发现酵母细胞中麦角甾醇被抑制时，会引起线粒体DNA的丢失，从而影响线粒体呼吸作用。2种机制相互作用，表现出氟唑菌酰羟胺与咪鲜胺复配剂的抑菌增效作用，该研究结果将为研究开发新的枸杞根腐病防治制剂、降低抗药性风险提供理论参考。