巨噬细胞极化介导肠缺血再灌注损伤的研究进展

张贻帼 景祎馨 潘 锐 丁 可 图拉妮萨·喀迪尔 罗 杰 廖师师 孟庆涛

肠缺血再灌注(intestinal ischemia reperfusion，IIR)是指肠道组织遭受缺血打击及后续恢复血供的病理生理过程，大多由急性肠梗阻、肠系膜动脉栓塞、小肠移植术、休克、外伤及各种手术等引发。糖原、ATP耗竭及线粒体功能障碍导致的细胞代谢应激是肠组织遭受缺血性损伤后的特点。继发性再灌注损伤是指血流恢复后，由于氧和营养物质供应不足以及代谢副产物的参与而造成的器官损伤，代谢紊乱、大量活性氧 (reactive oxygen species，ROS)、细胞因子和趋化因子进一步刺激各种免疫细胞产生严重的炎性反应，导致肠道黏膜屏障受损、通透性升高，炎性反应产生的超氧化物、过氧化氢和炎性细胞因子可活化巨噬细胞和中性粒细胞而加剧损伤。IIR不仅导致肠道本身的结构和功能改变，还会导致肠道菌群移位，引起肾脏、肺、肝脏等远隔脏器损伤，更严重的甚至会导致死亡[1]。

IIR后引起肠道本身及其远隔脏器损伤的机制十分复杂，目前未能完全阐明。作为人体最大的免疫器官，肠道中含有许多免疫细胞，如肠道巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)和自然杀伤T细胞(natural killer T cell,NKT)等，它们在IIR及远隔脏器损伤中起关键作用，尤其是肠道巨噬细胞[2]。肠损伤的显著特征是由于血单核细胞的渗透和单核细胞来源的巨噬细胞的分化，导致肠道中巨噬细胞的数量增加。缺血再灌注相关巨噬细胞活化和相关炎性细胞因子爆炸是IIR损伤甚至原发性无功能障碍的关键。越来越多的证据表明，巨噬细胞通过调整其功能极化状态对多种器官的缺血再灌注损伤过程有决定性的作用[3, 4]。

一、巨噬细胞概述

1. 肠道巨噬细胞：组织内的巨噬细胞是高度特化的吞噬细胞，在组织发育、稳态和再生过程中发挥支持功能[5]。肠道巨噬细胞位于黏膜单层上皮的下方，在这里它们表现出显著的功能多样性。能够清除细菌和外来物质，清除衰老或死亡细胞，支持Treg细胞，修复组织，重塑细胞外基质，促进上皮细胞更新[6～10]。巨噬细胞通过分泌有丝分裂因子，如胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和白细胞介素(interleukin，IL)-11，还能分泌细胞外基质稳定剂和金属蛋白酶抑制剂促进结肠创面愈合过程中上皮祖细胞的存活和增殖[11]。巨噬细胞的不同功能依赖于这些细胞识别微环境中不同分子的能力，并以维持体内平衡为目标对不同的刺激作出相应的反应。简而言之，这些细胞对于识别和消除入侵因子和细胞废物十分重要，同时它们也参与组织修复和重建工作。其实从某种意义上来说巨噬细胞在不同组织微环境的不同细胞群的主要目的就是为了维持组织器官的平衡[12]。在肠道中它们可能具有自相矛盾的功能，因为它们必须保持对共生微生物群和来自食物的许多抗原的耐受性，同时保持着对潜在病原体的高度警惕性[13]。这种平衡对于避免感染和防止不必要的炎症非常重要。当这种平衡被打破时，疾病总是随之而来。

2.巨噬细胞极化：由于巨噬细胞具有很强的可塑性，能根据所处的不同组织微环境及细胞因子谱活化为不同功能的异质细胞群，该过程被称为巨噬细胞的极化[14]。这两种类型分别代表了巨噬细胞激活状态的连续谱上的两个极端。巨噬细胞极化不平衡通常与炎性疾病相关，在特定的临床条件下也可看到不同激活的巨噬细胞共存。了解巨噬细胞极化的机制及其所涉及的分子有助于建立一系列临床诊断和治疗方法。

经典激活的巨噬细胞(classically activated macrophages，M1)，区别于由干扰素-γ或Toll样受体配体刺激的巨噬细胞，主要参与启动和维持炎性反应。这类巨噬细胞的特征是高表达CD80、CD86、MHCⅡ、Toll样受体4和诱导型一氧化氮合酶，能分泌大量促炎性细胞因子，具有很强的破坏肿瘤和微生物的能力；可分泌IL-6、肿瘤坏死因子-α、IL-1、IL-12、IL-15和IL-18等促炎性细胞因子，还可以分泌CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL15和CXCL20等趋化因子，募集Th1细胞等其他免疫细胞，诱导严重的Th1免疫反应；可作为先天免疫效应细胞，分泌 ROS 和一氧化氮(NO)。天然免疫细胞及获得性免疫细胞都可产生干扰素-γ，天然免疫细胞的代表是NK细胞，它可以维持巨噬细胞的早期瞬时激活，而获得性免疫细胞(Th1细胞)分泌的干扰素-γ是维持巨噬细胞长期激活所必需的。激活的巨噬细胞通过分泌超氧阴离子、活性氧和氮物种并促进Th1免疫来增加细胞杀伤力[15]。

交替激活的巨噬细胞(alternatively activated macrophages，M2)，区别于IL-4/13刺激的巨噬细胞，主要参与炎症消退和组织损伤修复，并具有促血管生成和促纤维化的作用。这类巨噬细胞的特征是高表达CD206、CD161、精氨酸酶(Arg-1)、壳多糖酶3样蛋白(chitinase-3-like protein 1,CHI3L1)和炎性局部分子，在抗炎、抗寄生虫活性、促进血管生成、促进创面愈合和细胞外基质纤维化等方面发挥着重要作用，也可刺激肿瘤的发生[15]。M2型又可具体分为M2a、M2b、M2c和M2d型。M2a型巨噬细胞在IL-4和IL-13的诱导下分化，在免疫复合物和Toll样受体配体的诱导下分化为M2b型，M2c型的分化在IL-10和肿瘤坏死因子-β的诱导下发生。嗜碱性粒细胞、肥大细胞和其他粒细胞是IL-4早期分泌的主要来源，可诱导巨噬细胞分化。IL-4可刺激M2型表达Arg-1，促进细胞外基质的产生，从而促进组织再生和伤口修复。M2型可以分泌抗炎性细胞因子IL-10、趋化因子CCL22和CCL17，促进Th2细胞的募集和激活，抑制过度免疫反应。然而，当M2型过度促进细胞外基质的修复和重组时，也会造成损害。研究表明慢性血吸虫病的组织纤维化是由于伤口愈合过程中M2型巨噬细胞的失控激活所致。当抑制M2型上的IL-4受体或使用针对IL-4受体的抗体时，可以减轻病变的纤维化程度[16]。表1总结了不同状态下巨噬细胞的不同标志物及诱导因子。上述证据均表明，在缺血再灌注损伤中，从促炎型M1型巨噬细胞到修复型M2型巨噬细胞的转换和组织损伤到组织修复的转变是同步的。

表1 巨噬细胞的表型及主要功能

二、M1/M2型巨噬细胞与 IIR 的关系

IIR损伤的显著特征是由于血单核细胞的渗透和向单核细胞来源的巨噬细胞的分化，导致肠道中巨噬细胞的数量增加。Chen等[17]研究结果显示，IIR后巨噬细胞会分泌大量的MPO进而损伤细胞功能；McGinn等[3]研究发现，IIR后，巨噬细胞会向M1型极化，并分泌 TNF-α 加重肠道损伤；而在人为竭耗了巨噬细胞 MPO分泌减少，肠道损伤明显较对照组减轻。同样的结果，Brencher等[18]研究发现，减少巨噬细胞的聚集可以明显减轻IIR损伤，Wen等[19]研究还发现，竭耗巨噬细胞能减轻肠缺血所致的肝损伤。

由于巨噬细胞的高度可塑性，使其能够适应环境刺激改变表型，越来越多的研究报道称，促进M1型转化为M2型可以减少IIR的损伤[20]。肠道菌群在此过程中也发挥着重要作用，乳酸杆菌在肠道免疫功能中发挥重要作用，提高 T 淋巴细胞活性，影响M1/M2型巨噬细胞比例[21]。罗伊乳杆菌通过触发巨噬细胞产生NO来保护小鼠免受鼠伤寒沙门菌的攻击[22]。此外，植物乳杆菌 CLP-o611通过极化M1型至M2型样巨噬细胞改善小鼠结肠炎[23]。肠道微生物乳杆菌可以通过 Toll样受体信号通路促进 M2型巨噬细胞释放 IL -10 减轻IIR 损伤[24]。

另有研究显示，称巨噬细胞极化还可影响肠神经元的催产素(oxytocin,OT)及受体(oxytocin receptor,OTR)的表达，来调节胃肠道的分泌、运动及免疫[25]。LPS诱导的M1型巨噬细胞可产生促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α，通过STAT3/NF-κB信号通路抑制肠神经元OT及OTR的表达；M2型巨噬细胞可产生抗炎性细胞因子TGF-β，通过激活Smad2/3并抑制peg3的表达，从而促进肠神经元的OT和OTR表达；在结肠炎小鼠模型中，炎症期间的M1型巨噬细胞的OT和OTR表达显著降低，而恢复期间的M2型巨噬细胞的OT和OTR表达显著增加。推测在IIR损伤过程中，大量炎性细胞因子释放，炎症期和恢复期的 M1/M2型巨噬细胞比例及 OT/OTR的表达有密切关联，同时还影响了肠道的分泌及运动。前颗粒素(progranulin,PGRN)能抑制M1型极化，D-甘露糖能诱导M2型极化，从而增加OT和OTR的表达[25, 26]。巨噬细胞除了能通过肠神经介导胃肠运动外，也可以绕开肠神经系统，直接作用于肠平滑肌细胞，促进胃肠蠕动[27]。在IIR损伤过程中，后期总伴随着肠道内持续的炎症变化以及肠道蠕动变慢等长期胃肠症状，这种肠道损伤伴随着兴奋性肠神经元的持续性丢失，肠肌巨噬细胞可对肠道感染作出快速应答，通过β2-肾上腺素-精氨酸酶1-多胺轴信号通路，来限制感染导致的肠神经元死亡[28]。

为了研究M1/M2型转换在IIR中的作用，Liu 等[20]在IIR损伤不同时期检测小鼠肠组织M1型表面标志物(NOS2、CCR7)和M2型表面标志物(Arg-1、Fizz1)水平，结果表明在IIR早期则有巨噬细胞的激活，可见M1型表面标志物增多，M2型标志物水平降低，且可以观察到肠组织明显损伤，证明了 M2 向 M1型转化与肠细胞损伤呈正相关；而应用重组旋毛虫蛋白(rTs p38)后可以促进 M1向 M2型转化，还可逆转M2型向M1型的转变，增强 Th2 型免疫反应，同时促进肠黏膜损伤的修复和肠功能的恢复，并伴有中性粒细胞减少和肠道细胞增殖的增加；同样的研究证明桔梗皂苷D通过单磷酸腺苷激活的蛋白激酶调节M2型巨噬细胞极化来减轻肠道炎症，保护肠道屏障功能[29]。人参皂苷Rg1通过Nogo-B/Rho A信号通路诱导M2型极化，可以有效地治疗小鼠复发性结肠炎[30]。为了进一步研究M1/M2型转化的机制，Liu 等[20]使用 STAT6 抑制剂则通过抑制M1型到M2型的转换，同时还逆转了 rTs p38的肠道保护作用，说明M1/M2型转换可能具有 STAT6 依赖性。Liu等[31]研究发现在心肌梗死后能引起IIR损伤，在损伤期间使用特利加压素，通过 PI3K/Akt 途径升高血压，抑制肠上皮细胞凋亡和巨噬细胞 M1型极化，对肠道损伤具有保护作用。

三、M1/M2型巨噬细胞与缺血再灌注相关信号通路

1.Notch信号通路：Notch信号通路是一种进化保守的通路，通过诱导M1型极化参与肠道炎症[32]。过度激活Notch通路后，巨噬细胞只会向M1型极化，而阻断此通路后，巨噬细胞会失去向M1型分化的能力[33]。IIR后 Notch 1 的表达增加，进而激活 NF-κB p65，促进巨噬细胞向M1型分化并分泌促炎性细胞因子，从而导致肠道细胞凋亡增加，肠组织损伤加重[34]。

2.JAK/STAT信号通路：JAK是一种细胞内蛋白激酶，通过多种受体进行信号转导而被激活。细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling， SOCS)是JAK/STAT信号通路的反馈抑制剂，可以终止免疫应答。在此过程中，SOCS1的激活和SOCS3的抑制促进M2型极化。在肾缺血再灌注过程中，近端小管SOCS3的缺失通过直接增加JAK/STAT信号通路支持肾上皮再生。此外，SOCS3缺失导致向M2型巨噬细胞转移。在近端小管细胞中靶向SOCS3治疗激活JAK/STAT可能有助于改善AKI过程中的局部免疫调节和组织修复[35]。

3.PI3K/Akt信号通路：Akt有3种亚型: Akt1～3，Akt1促进M2型极化，Akt2促进M1型极化，这是因为它们在调控miR-155及其靶蛋白C/EBpb(巨噬细胞分化的主要调节因子)中发挥相反的作用。有研究证明，加压素能通过激活PI3K/Akt信号通路，降低M1型极化，减轻心肌梗死及心肌梗死后的肠道损伤。Akt的异构体也在调控巨噬细胞激活中发挥关键作用。在心肌梗死模型中，主要激活的是Akt2。腺苷A2B可能通过 PI3K/Akt 通路调节心肌巨噬细胞表型，并具有抗炎作用，从而保护心脏免受IR损害。

4.p38/JNK 信号通路：JNK是一种丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，可以调节多种细胞功能，可在缺血/再灌注时期被激活。抑制JNK活性后，肺 I/R 损伤得到改善。有研究证明p38/JNK信号通路介导M1型极化，其信号通路的增强可导致体内I/R后细胞凋亡显著增加，而过表达miR-132-3p能下调丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase/extracellar signal-regulated kinase kinase kinase 3,MEKK3)，抑制M1型极化，能减轻脊髓再灌注损伤。

四、展 望

巨噬细胞在人体免疫系统中起着非常复杂的作用。它可以对特定的环境信号作出表型和功能上的动态转换，这种独特的功能转换是巨噬细胞对启动免疫反应和组织修复重塑的基础。M1型组成固有免疫的第一道防线，吞噬消灭病原体，激活T淋巴细胞的适应性免疫，但M1型促炎能力过强会促进炎症性疾病的进展；M2型主要参与血管生成，抗炎性细胞因子分泌及促进组织修复和纤维化，但是同时也会促进肿瘤的进展。本文简要介绍了巨噬细胞系统在IIR损伤中的重要作用，也为其治疗的临床运用提供一些参考，如异甜菊醇通过上调 miR-146a可诱导M2型巨噬细胞极化从而改善小鼠肠缺血再灌注损伤[34]；特利加压素可通过PI3K/Akt通路抑制肠上皮细胞凋亡和巨噬细胞M1型极化，从而减轻肠道损伤[31]；应用重组旋毛虫蛋白(rTs p38)后可以促进M1型向M2型极化，同时还能逆转M1型的极化，增强 Th2 型免疫反应，使用了STAT6 抑制剂却能逆转rTs p38的保护作用，说明M1/M2型转换可能具有 STAT6 依赖性。这在很大程度上有助于加深对肠缺血再灌注的发病机制的认识，并促进依赖于调节巨噬细胞功能和极化的新的治疗方法的发展，但是，介导巨噬细胞表型异质性和功能可塑性的具体分子在很大程度上仍是未知的，此外，巨噬细胞表型从M1型到M2型的动态转化机制还有待于通过基因组和药理学技术开展大量研究予以进一步证实。