宏基因组二代测序在社区获得性肺炎中的应用价值

张娟娟 闫晓培 李 宁

社区获得性肺炎是呼吸系统常见病、多发病。起始治疗以经验性抗感染治疗为主，部分患者治疗失败后出现病情延误及进展，对于初始治疗失败及重症患者而言，明确病原体有利于精确指导治疗，改善患者预后。传统病原学检测方法检出阳性率低，病原学培养周期长，非典型病原体难以被培养。宏基因组二代测序技术(metagenomic next-generation sequencing， mNGS)是运用高通量基因测序、不依赖传统的微生物培养而明确样本中所有微生物的分类和功能的技术，能够快速、客观地检测临床样本中的病原微生物，包括细菌、真菌、病毒及寄生虫等，广泛应用于感染性疾病的诊治，较传统的检测手段更有优势，能明显提高感染性疾病的诊治效率和优化抗生素的管理[1,2]。mNGS在成人社区获得性肺炎的报道相对较少，本研究对苏州市立医院初治失败的社区获得性肺炎患者的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)进行mNGS检测，探讨mNGS检测技术在成人社区获得性肺炎中的应用价值。

对象与方法

1.研究对象：招募2018年11月～2021年7月苏州市立医院收治的57例初始治疗效果不佳的社区获得性肺炎患者为研究对象。纳入标准：①符合中国成人社区获得性肺炎的诊断标准[3]；②抗生素治疗72h后出现咳嗽、咳痰或胸闷、气急等症状未见好转，仍有发热，体温大于38℃，白细胞计数、降钙素原或C反应蛋白等炎性指标持续升高，机械通气；③抗感染2周后复查胸部CT，肺部病灶未吸收或较前进展，所有患者抗生素治疗失败后均接受支气管镜检查，采集BALF同时进行了传统方法和mNGS检测。排除标准：①年龄<18岁；②临床资料不完整。

2.资料收集：通过住院电子病历系统，收集入选患者的性别、年龄、基础疾病、血常规、C反应蛋白、G试验、GM试验、痰培养、抗生素使用情况、BALF病原学检测结果、影像学资料、治疗前后的症状及体征、出院诊断等一般信息。

3.检测方法：抗生素治疗失败后，57例患者均接受支气管镜检查，所得BALF同时进行传统方法和mNGS检测。传统方法包括细菌、真菌培养、利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)以及呼吸道病毒聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测等。Xpert MTB/RIF kit 购自美国Cepheid公司。BALF的mNGS检验由广州微远基因科技有限公司进行，包括DNA和RNA两部分测序。BALF的采集、保存及运输均符合标准[4]。将BALF进行灭活处理，提取总核酸后，文库制备包括随机引物建库、PCR扩增等，对合格文库进行上机测序,然后去除人源宿主序列,再与病原数据库中的参考序列进行比对，来确定BALF中可能致病的微生物。参考疑似背景微生物库及阴性对照检测结果，并结合所提供临床信息，最终生成检测报告。所有患者行支气管镜及mNGS检测前均签署知情同意书。本研究通过苏州市立医院医学伦理学委员会审批(伦理审批号：K-2020-077-K01)。

4.临床分析：57例患者的临床病史、炎性指标、胸部CT、病原学结果等资料均由两位呼吸内科主任医师独立分析并判断病原菌。意见不统一的结果，共同讨论后再决定。

结 果

1.一般临床资料：57例社区获得性肺炎患者中，男性29例(50.88%)，女性28例(49.12%)，患者平均年龄为59.23±15.76岁，重症肺炎4例(7.02%)，入院平均白细胞计数为(7.65±3.85)×109/L，中性粒细胞百分比为66.88%±13.67%，合并基础疾病42例(73.68%)。

2.两种检测方法检出结果比较：在57例社区获得性肺炎的BALF中，传统方法检测19例标本阳性，检出率为33.3%；BALF培养14例阳性，Xpert MTB/RIF 7例阳性，PCR检测出1例H1N1。mNGS共检出病原体46例，检出率为80.7%。mNGS检出率明显高于传统方法，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。将两种方法检测结果比较，两种方法均检测出阳性15例(26.32%)，阴性出7例(12.28%)，mNGS检测阳性而传统方法检测阴性者31例(54.39%)，mNGS检测阴性而传统方法检测阳性者4例(7.02%)，两种方法检测结果的差异有统计学意义(P<0.05)，两种方法均检测阳性的15例中，结果完全一致有7例(12.28%)，部分一致有4例(7.02%)，不一致有4例(7.02%)，详见图1。在结核诊断方面，传统方法检测7例阳性，mNGS 检测4例阳性；其中4例Xpert MTB/RIF和mNGS均检测阳性，3例Xpert MTB/RIF检测阳性而mNGS检测阴性。在细菌感染方面，mNGS检出率43.9%，明显高于传统方法的检出率15.8%，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但是在检测真菌、结核及病毒感染方面，两种方法比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 两种方法检出不同种类病原体的比较[n(%)]

图1 mNGS与传统方法检测结果比较

3.诊断和治疗的调整：将患者临床表现、辅助检查、mNGS结果及传统方法检测结果综合分析，由两位年资高的呼吸科医生独立分析并判断是否确诊及其病原体。46例患者mNGS 检测阳性，其中39例(84.78%)予采信并确诊，而7例因检测结果与临床表现、影像学结果不符合，未采信。在初治失败的社区获得性肺炎中，mNGS联合传统方法检测后，共有43例患者确诊。mNGS结果在确诊和未确诊患者中的情况详见表2。由此计算出mNGS的敏感度为90.70%，特异性为50.00%，阳性预测值为84.78%，阴性预测值为63.64%。43例确诊患者中，细菌性肺炎17例，肺结核7例，非结核分枝杆菌(non-tuberculous Mycobacteria，NTM)肺病6例，肺真菌感染5例，衣原体肺炎和支原体肺炎各1例，病毒性肺炎1例；其余5例为混合感染：细菌合并病毒感染3例，细菌合并真菌感染2例。57例患者中，25例患者根据mNGS结果调整了抗生素的治疗方案。

表2 mNGS检测在确诊和未确诊患者中的结果[n(%)]

讨 论

社区获得性肺炎是呼吸系统常见病及多发病，住院患者的病死率为2%～15%[5(7]。初治失败的肺炎患者需要重复行病原学检查明确致病病原体，并及时开始精准治疗，以降低其病死率、避免抗生素滥用及遏制细菌耐药。文献报道传统方法检测的社区获得性肺炎病原学阳性率为38%[7]。mNGS是一项新型核酸检测技术，能快速、客观、全面地检测临床标本中的细菌、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、病毒及寄生虫等所有微生物，已广泛应用于感染性疾病中[8]。本研究中， mNGS检测出46例阳性，其中有39例确诊，最后43.86%的患者根据mNGS检测结果调整了抗生素方案。由此可见，对于社区获得性肺炎患者，若初治失败的患者，推荐留取呼吸道标本进行mNGS检测，可以早期识别病原体及时指导抗生素治疗[4]。

Wang等[9]回顾性分析了55例血液系统恶性肿瘤患者的肺活检和BALF送检mNGS结果，其病原学检出率明显高于传统方法，敏感度为97.2%，特异性为63.2%。Chen等[10]回顾了40例疑似肺炎患者的BALF mNGS，敏感度为81.3%，特异性为76.9%。本研究57例病例， BALF mNGS的病原学检出率为80.70%，明显高于传统方法检出率为33.33%。mNGS敏感度为90.70%，特异性为50.00%，敏感度与研究报道相似，特异性略低。

研究显示，在感染性疾病中，mNGS较传统方法对真菌、结核和病毒的检出敏感度更高[11,12]。然而本研究中肺泡灌洗液mNGS的细菌检出率明显高于传统培养，但真菌、结核和病毒的检出率无差异，这可能与本组病例特点有关。本研究除了4例重症肺炎外，其余均是普通社区获得性肺炎，总体病情较轻，并且大部分是免疫正常的社区获得性肺炎，常见的病原体是以肺炎链球菌为主的细菌和支原体，真菌、结核和病毒感染较少见。

本研究中Xpert MTB/RIF检出7例结核分枝杆菌，mNGS检出3例，两种方法检测结核分枝杆菌的结果无差异。由于结核分枝杆菌是胞内菌，释放到体液中的含量少，核酸不容易被提取， 所以mNGS检测的敏感度偏低[2]。当 BALF mNGS的结核分枝杆菌序列数和丰度很低时，也要考虑肺结核的可能。研究显示，将疑似结核患者的标本同时送检mNGS和Xpert MTB/RIF，mNGS检出结核分枝杆菌的敏感度和特异性与Xpert MTB/RIF类似[13～15]。若将两种方法联合检测，敏感度和特异性会明显升高，mNGS还可以同步检出结核患者伴随感染的其他病原体，但检测前的试验性抗结核治疗会降低mNGS的阳性率[13]。

本研究mNGS共检出9例NTM，6例诊断为NTM肺病，其余3例因序列数较少且与临床表现不符合而未采信。文献报道，NTM的发生率和患病率呈逐年增加的趋势[16,17]。在社区获得性肺炎患者初治失败后，需要警惕NTM感染可能，尤其是有结构性基础肺病的老年患者[18]。因为NTM广泛存在于环境中，可能造成标本的污染，mNGS送检标本排除环境污染后，若NTM序列数位于前10位时，需要考虑为NTM感染[12]。相比传统培养耗时长、阳性率低，mNGS检测NTM的优势更明显，从采样到完成数据分析的周转时间平均48h，还可以确定NTM的具体种类[4，14]。

mNGS也有自身的局限性，无法区分感染和定植，耐药检测困难，其敏感度高可能存在假阳性，缺乏统一的解读标准，临床实践中可能存在错误解读，临床工作者必须综合考虑患者的临床症状、影像学特点、自身免疫情况等，才能得出最终的结论。

综上所述，在初始治疗失败的社区获得性肺炎患者中，BALF mNGS的检出率高于传统方法，尤其是对于细菌感染的诊断价值更高，可早期识别病原体，有效指导诊治。由于本研究是回顾性研究，纳入样本量少，无法避免选择性偏倚；因住院资料局限性，无法比较调整抗生素方案后的治疗效果；因选择的样本是社区获得性肺炎患者且大部分是轻症，无法全面反映mNGS的检测效能，还需要开展大量前瞻性研究予以进一步证实。