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MiR-130b-3p在非小细胞肺癌患者血液中的表达及潜在意义

2022-02-09李靖霄李国盛徐阳何融泉周华富孔晋亮陈罡

岭南现代临床外科 2022年6期
关键词:血液样本基因

李靖霄,李国盛,徐阳,何融泉,周华富,孔晋亮,陈罡*

肺癌(lung cancer,LC)是中国最常见且病死率最高的癌种;最新的研究报道显示,在世界范围内的恶性肿瘤中,LC的发病率和病死率分别位居第二和第一[1,2]。根据病理分型,LC常被分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两种亚型,而前者约占LC的85%[3]。肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)是最常被诊断的NSCLC组织学亚型[4]。随着诊断和治疗技术的进步,手术联合新型放化疗已可使NSCLC患者5年生存率达到21.7%[5]。然而,更多的患者在确诊时肿瘤已进展到晚期,这让常规治疗方法的疗效不容乐观[6,7]。因此,挖掘有效的临床筛查和治疗NSCLC的标志物,对降低患者病死率和提高患者生存质量尤为重要。

微小RNA(microRNAs,miRNAs)可通过调控信使RNA的表达而影响转录过程[8]。作为miR-130家族的一员,miR-130b-3p已被报道参与调控多种肿瘤的进展,但其调控作用与调控机制在不同肿瘤中却不尽相同[9]。例如,miR-130b-3p在肝细胞癌、乳腺癌、前列腺癌中被认为具有抑制肿瘤发展的作用,而在膀胱癌、肾母细胞癌、胃癌中被认为具有促进肿瘤发展的作用[10-15]。此外,miR-130b-3p在NSCLC中的作用也已被初步报道。一些针对人工培育NSCLC细胞和NSCLC患者肿瘤组织的研究表明,miR-130b-3p具有促进癌细胞增殖、侵袭和转移的作用[16-18]。尽管Ulivi等人的研究提到,血液中miR-130b-3p的表达与NSCLC患者的总生存率显著相关,但他们并未阐明miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达情况与临床意义[18]。此外,这些有关miR-130b-3p和NSCLC的研究均属于单中心的小样本研究,未探索miR-130b-3p应用于筛查NSCLC的潜在价值,且未阐明miR-130b-3p在NSCLC中的作用机制。因此,应用大量样本进一步探索miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达水平和作用机制对明确miR-130b-3p的潜在临床应用价值至关重要。

本研究旨在通过分析来自公共数据库的miRNAs表达谱,以探究miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达水平及鉴别该疾病的潜力,从而挖掘miR-130b-3p筛查和治疗NSCLC的潜在临床意义。

1 资料与方法

1.1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达水平

为采集用于分析miR-130b-3p在NSCLC中的表达水平与鉴别潜力的数据,本研究以“lung AND(tumor OR cancer OR carcinoma OR neoplasms)

AND(microRNA OR miRNA)”作为检索式,在基因表达谱数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)以及序列片段归档数据库(Sequence Read Archive,SRA)中进行检索。同时,为了检索与提取癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中收录的数据,Xena数据库被用于下载LC相关数据集。数据集纳入条件如下:①研究对象为智人;②数据应来自血液,包括全血、血浆等;③数据集需包含miR-130b-3p表达数据;④每个数据集需包含至少3个肿瘤和3个非肿瘤样本;⑤样本未经过任何药物或其它化学物质处理。随后,将所收集到的数据按照测序平台进行合并,并进行了log2(x+1)转换。

为观察不同NSCLC亚型中miR-130b-3p的表达水平,本研究根据肿瘤亚型将所有样本分为两组,分别为LUAD和LUSC组。首先,对数据集的平均值、标准差、敏感度、特异度进行计算,并根据分组进行记录。接着,各个数据集的miR-130b-3p表达水平被绘制成散点图和受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线。为了综合展示各个数据集的结果,标准化均数差(standardized mean difference,SMD)和诊断性似然比(diagnostic likelihood ratio,DLR)也被计算。我们还绘制森林图与综合受试者工作特征(summaryreceiver operating characteristic,sROC)曲线。由于可收集到的数据有限,本研究在此将LUAD和LUSC的数据集合并分析。曲线下面积(area under curve,AUC)的百分比值大小是在ROC及sROC曲线中评判miR-130b-3p鉴别NSCLC的潜力的标准。

1.2 MiR-130b-3p下游靶基因的筛选

MiRwalk 2.0纳入了12个数据库的miRNAs和基因的表达情况,具有预测miRNA-靶基因关系的功能。本研究将“miR-130b-3p”作为关键词在MiRwalk 2.0中进行检索。对检索到的靶基因基于下列条件筛选:结合分数(binding score)等于1且同时在12个数据集中被认为是miR-130b-3p的靶基因。将筛选到的基因输入检索相互作用基因的搜索工具(search tool for the retrieval of interacting genes,STRING)分析靶基因之间作用关系,并构建蛋白质-蛋白质交互(protein-protein interaction,PPI)网络。随后,根据各基因相互作用的degree值筛选出的枢纽基因(hub genes)被选用于后续分析。

1.3 富集分析

将筛选得到的miR-130b-3p下游靶基因输入注释、可视化和集成发现数据库(database for annotation,visualization and integrated discovery,DAVID)v 6.8进行富集分析。本研究选择了基因本体(Gene Ontology,GO)-生物过程(biological process,BP)、GO-细胞成分(cellular component,CC)、GO-分子功能(molecular function,MF)对miR-130b-3p下游靶基因进行功能富集,同时应用京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,以探讨miR-130b-3p下游靶基因调控肿瘤发展的潜在信号通路。

1.4 数据分析

在本研究中,Graphpad prism 8.0被用于构建散点图及描绘ROC曲线。应用IBM SPSS 23.0计算数据平均值和标准差。Stata 14.0被用于计算SMD和DLR并绘制森林图与sROC曲线。在线数据库miRwalk 2.0以及DAVID v6.8分别被用于预测miR-130b-3p的下游靶基因和下游靶基因的潜在信号通路。我们使用Cytoscape v3.7.1的cytohubba模块筛选出了miR-130b-3p下游靶基因的枢纽基因。

2 结果

2.1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中低表达

在本研究中,共有来自公共数据库的7项研究被纳入分析(表1)。

在4个纳入的LUAD数据集中,有3个表明miR-130b-3p在LUAD组和对照组血液样本间的表达差异被认为具有统计学意义(P<0.05)(图1A~D)。如 图1E~G所 示,在3个 纳 入 的LUSC数据 集 中有1个表明在LUSC组和对照组血液样本间miR-130b-3p的表达差异被认为具有统计学意义(P<0.05)。根据各个数据集ROC曲线的AUC,我们认为使用在NSCLC患者血液中低表达的miR-130b-3p具有良好的预测价值(图2)。

图1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中表达水平的散点图A~D:样本来自LUAD患者血液;E~G:样本来自LUSC患者血液

图2 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的ROC曲线A~D:分别为GSE27486、GSE40738、GSE152702和GSE171517的ROC曲线;E~G:分别为GSE40738、GSE152702和GSE171517的ROC曲线

为了进一步明确miR-130b-3p在NSCLC患者血液的表达水平,本研究综合计算了miR-130b-3p的SMD(表2)。结果表明,在LUAD中,SMD=-1.45,95%置信区间(confidence interval,CI)为-2.66~-0.23;在LUSC中,SMD=-0.46,95%CI:-0.84~-0.09(图3A)。未发现SMD结果存在明显的发表偏倚(图3B)。因此,目前结果显示miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表达量显著低于健康人血液。综合结果,我们发现在NSCLC患者血液中低表达的miR-130b-3p具有较好地区分肿瘤组织和正常组织的潜力(AUC=0.85,95%CI:0.82~0.88)(图3C)。图3D提示纳入的NSCLC组织数据集具有较低的阴性DLR以及较高的阳性DLR。

图3 MiR-130b-3p在NSCLC患者体内的表达水平及鉴别潜力A:MiR-130b-3p在血液中表达水平森林图,上半部分表示其在LUAD血液样本中的表达水平,下半部分表示其在LUSC血液样本中的表达;B:漏斗图展示所纳入血液样本的发表偏倚;C:MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的sROC曲线;D:在NSCLC患者血液中miR-130b-3p的DLR注:LUAD,肺腺癌;LUSC,肺鳞状细胞癌;sROC,综合受试者工作特征;NSCLC,非小细胞肺癌;DLR,诊断性似然比

表2 在7项纳入的研究中,miR-130b-3p在NSCLC患者和健康人血液中的表达水平平均值与标准差

2.2 探索miR-130b-3p的下游靶基因

在miRwalk 2.0中,本研究筛选出了47个miR-130b-3p的下游靶基因,并通过PPI网络展示了他们之间的联系(图4A)。根据各下游靶基因间的degree值,我们筛选出了前10个degree值最高的下游靶基因作为枢纽基因,分别为ESR1、AGO1、DDX6、MTMR9、CFL2、TRIM2、QKI、FMR1、TNRC6B和BRWD1(图4B)。所筛选出的下游靶基因们将被用于后续分析。

2.3 富集分析

结果显示,在GO-BP分析中,miR-130b-3p下游靶基因显著富集于protein phosphorylation、mRNA processing和RNA splicing(图4C)。在GO-CC分析中,miR-130b-3p下游靶基因显著富集于lysosome、early endosome membrane和processing body(图4D)。在GO-MF分析中,miR-130b-3p下游靶基因显著富集于protein binding、chromatin binding和protein serine(图4E)。KEGG分析结果表明,miR-130b-3p下游靶基因显著富集于endocytosis和axon guidance通路(图4F)。这些结果提示miR-130b-3p可能通过参与相关通路的调控进而影响NSCLC的发展。

图4 MiR-130b-3p下游靶基因的富集分析A:使用miR-130b-3p下游靶基因构建的PPI网络图;B:MiR-130b-3p下游靶基因的枢纽基因(hub genes);C:在GO_BP分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情况;D:在GO_CC分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情况;E:在GO_MF分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情况;F:在KEGG富集分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情况

3 讨论

在本研究中,基于300例血液样本的miR-130b-3p表达水平,我们首次提出miR-130b-3p在NSCLC患者血液中表达下调。同时,我们发现在血液中低表达的miR-130b-3p具有显著的筛查NSCLC患者的潜力。47个基因被鉴定为miR-130b-3p的下游靶基因,且根据这些靶基因探索miR-130b-3p参与调控NSCLC发生发展的潜在信号通路。

近年来,已有一些研究报道了miR-130b-3p在NSCLC中的表达水平及生物学作用。基于分析55例组织样本,Yu等[16]人发现miR-130b-3p的表达水平在来自NSCLC患者体内的癌细胞中明显升高,并与肿瘤细胞的增殖和转移速度呈正相关,且敲低miR-130b-3p后,肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移随之受到抑制。Guo等[17]人发现miR-130b-3p在人工培育的NSCLC细胞中表达上调;而敲低miR-130b-3p的NSCLC细胞具有更低的增殖、侵袭和迁移能力,提示了miR-130b-3p表达可能影响NSCLC的进展。通过分析99例LUAD样本和83例LUSC样本的血液miRNAs表达水平,Ulivi等[18]人报道了高表达的miR-130b-3p与LUSC患者的无瘤生存期呈明显负相关,且与LUAD患者的总生存率呈明显负相关。这些研究提示了miR-130b-3p在NSCLC的表达差异及重要生物学功能,但存在样本量较小(n≤182)、仅基于单中心数据等问题,他们也并未阐明miR-130b-3p在血液中的表达水平。在本研究首次通过来自公共数据库大样本探讨了miR-130b-3p在NSCLC患者血液内的表达水平,并发现相较于健康人的血液,miR-130b-3p在NSCLC患者的血液中呈现明显的低表达。已有的研究认为,细胞凋亡和活性分泌是血液中miRNAs的重要来源,当细胞凋亡和活性分泌活跃时,血液中miRNAs含 量 上调[19]。Guo等[17]人认为,miR-130b-3p主要来自间充质干细胞,并通过胞外囊泡分泌转移至NSCLC细胞内,从而促进NSCLC细胞的增殖、侵袭和转移。因此,我们推断NSCLC患者间充质干细胞分泌的miR-130b-3p随血液转移至NSCLC细胞内,导致患者血液中miR-130b-3p含量较正常人的更低;同时,由于肿瘤细胞凋亡活动减弱,患者血液中miR-130b-3p将持续处于低水平。

现有研究表明,血液中miRNAs可作为某些肿瘤的生物标志物[20]。一些研究也通过诊断试验鉴定了多个具有作为NSCLC早期筛查的生物标志物前景的miRNAs[21-23]。在本研究中,诊断试验结果显示miR-130b-3p的AUC=0.85,提示miR-130b-3p可以较为准确地鉴别NSCLC患者和健康人。因此,我们提出通过检测血液中miR-130b-3p的表达水平,有助于筛查NSCLC。在未来投入更多的精力研究miR-130b-3p在NSCLC患者血液的表达水平,对早期预测NSCLC及其预后具有积极作用。

本研究尚存在一些局限:首先,尚需在将来经过实验验证miR-130b-3p与下游靶基因的联系;其次,下游靶基因所显著富集的信号通路与NSCLC发展的关系尚无法阐明;最后,因可收集的样本有限,除了LUAD和LUSC外,本研究未能对NSCLC的其他亚型进行分析。

总之,本研究通过分析来自多中心的大样本数据,首次提出miR-130b-3p在NSCLC患者血液内表达下调,并有望用于NSCLC的筛查。

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