小鼠血清中胆汁酸的液相色谱串联质谱分析方法的建立

耿仕夏 ， 罗荪琳 ， 熊梦琴 ， 张丽英 ， 陈义强 ， 杨文军

(中国农业大学动物科学技术学院 动物营养学国家重点实验室 ， 北京 海淀 100193)

胆汁酸是胆汁的重要组成成分，是机体胆固醇代谢过程中产生的一系列胆烷酸的总称[1]。近年来研究结果显示，胆汁酸不仅可以促进脂肪和脂溶性维生素消化和胆囊胆固醇溶解，还可以作为信号分子通过激活多条信号通路调节胆固醇稳态、糖脂代谢和能量代谢[2-3]，对机体代谢发挥着非常重要的作用。反之亦然，机体生理状态的改变也会影响胆汁酸的组成和分布。研究发现，高脂高糖饮食的结肠癌患者通过粪便排出的次级胆汁酸水平升高，特别是脱氧胆酸(Deoxycholic acid,DCA)和石胆酸(Lithocholic acid,LCA)，这不利于结肠上皮的结构和功能[4]。在2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠中发现血清中12α-OH胆汁酸与非12α-OH胆汁酸的比值增加，这为寻找可能的T2DM生物标志物提供线索[5]。因此，血清胆汁酸组分测定也许在某些疾病的早期无创诊断和治疗监测中具有重要意义。但目前对于不同种类胆汁酸在机体中发挥的生理作用及病理学功能尚不清楚，部分原因在于各类胆汁酸定量检测技术受限。因此建立动物体内胆汁酸代谢谱的检测方法，对深入探讨胆汁酸的生理功能和作用机制具有重要意义。

目前已建立了酶测定法、酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法、薄层色谱(Thin layer chromatography,TLC)、高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)、气相色谱串联质谱(Gas chromatography tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)和液相色谱串联质谱(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)等多种胆汁酸检测方法。酶测定法和ELISA法快速、方便、简单，但特异性低、检测限高[6-7]。TLC仅适用于定性分析，不能准确检测某类胆汁酸的水平[8-9]。HPLC、GC-MS和LC-MS具有较高的灵敏度和特异性，但是HPLC和GC-MS样品制备过程复杂甚至有时需要衍生化，增加了试验操作难度[10-11]。LC-MS/MS不需要衍生化过程，分析更快速和方便，且分析法灵敏度高、多靶标同步分析能力强，已成为胆汁酸分析的主要技术手段[12]。基于此，本研究采用基于同位素内标的LC-MS/MS分析方法测定小鼠血清中的胆汁酸。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪：Agilent Technologies 1290 Series，美国Agilent Technologies公司；串联四级杆质谱仪：Agilent 6490 Triple Quadrupole Mass Spectrometer，美国Agilent Technologies公司；超纯水仪：Millipore Milli-Q纯化系统，美国Merk Millipore公司；电子分析天平：BSA124S，德国赛多利斯科学仪器有限公司；全自动样品冷冻研磨仪：JXFSTPRP-CLN，上海净信实业发展有限公司；高速冷冻离心机：3-30K型，德国Sigma公司；旋涡混合器：HQ-60-Ⅱ，北京同方股份有限公司；HSC-24B水浴氮吹仪，天津恒奥科技发展有限公司。胆酸(Cholic acid,CA)、α-鼠胆酸(α-Muricholic acid,α-MCA)、β-MCA、熊脱氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)、牛磺α-鼠胆酸(Tauro-α-muricholic acid,Tα-MCA)、牛磺猪胆酸(Taurohyocholic acid,THCA)、牛磺猪去氧胆酸(Taurohyodeoxychoic acid,THDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)、甘氨猪胆酸(Glycohyocholic acid,GHCA)、甘氨石胆酸(Glycolithocholic acid,GLCA)、甘氨猪去氧胆酸(Glycohyodeoxycholic acid,GHDCA)、氘代鹅脱氧胆酸(CDCA-D4)、氘代石胆酸(LCA-D4)、氘代甘氨胆酸(GCA-D4)，均购自Steraloids公司；ω-MCA、LCA、鹅脱氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)、猪胆酸(Hyocholic acid,HCA)、猪去氧胆酸(Hyodeoxychoic acid,HDCA)、牛磺胆酸(Taurocholic acid,TCA)、牛磺石胆酸 (Taurolithocholic acid,TLCA)、牛磺熊脱氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)、牛磺去氧胆酸(Taurodeoxycholic acid,TDCA)、Tβ-MCA、牛磺鹅脱氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)、甘氨去氧胆酸(Glycodeoxycholic acid,GDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(Glycoursodeoxycholic acid,GUDCA)、甘氨β-鼠胆酸(Glyco-β-muricholic acid,Gβ-MCA)、氘代去氧胆酸(DCA-D4)，均购自Cayman Chemical公司；氘代牛磺胆酸(TCA-D5)、氘代牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA-D5)，均购自Toronto Research Chemical公司；DCA、Tω-MCA、甘氨胆酸(Glycocholic acid,GCA)，均购自上海甄准生物科技有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯，德国Merk公司产品；二甲基亚砜(DMSO)，色谱纯，美国Sigma Aldrich公司产品。

1.2 色谱条件 色谱柱：Waters BEH C18超高效液相色谱柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)；保护柱：Waters BEH VanGuard 保护柱(1.7 μm,2.1 mm×5 mm)。流动相：0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)。柱温：65 ℃，进样量：5 μL，流速：0.5 mL/min。洗脱程序：水相在0～0.5 min时体积分数为95%，0.5～5.0 min时体积分数变为85%，5.0～9.0 min时体积分数由85%变为75%，9.0～19.5 min时体积分数变为60%，19.5～21.5 min时体积分数由60%变为5%并保持至23 min，最后恢复初始条件。

1.3 质谱条件 电喷雾离子源(ESI),采用负离子模式(ESI-)。电喷雾离子源参数设置为雾化气温度300 ℃，雾化气气流7 L/min；鞘气温度350 ℃，鞘气气流7 L/min；毛细管电压4 000 V，采用多反应监测模式(Multiple reaction monitoring,MRM)。

1.4 溶液的配制

1.4.1 胆汁酸储备液及工作液 分别取28种胆汁酸标准品10 mg，精密称量，用DMSO定容至10 mL量瓶中，充分混匀后，得到浓度为1 mg/mL的各胆汁酸储备液。随后用50%甲醇-水稀释胆汁酸储备液得到浓度分别为1、10、50、100、500、1 000、3 000 ng/mL和100 000 ng/mL的28种胆汁酸的混合标准溶液，冷藏保存。

1.4.2 内标储备液及工作液 分别取各内标标准品溶液约10 mg，精密称量，用DMSO定容至10 mL量瓶中，充分混匀得到浓度为1 mg/mL的内标储备液。随后用50%甲醇-水稀释得到浓度为0.05、0.2、1、10 μg/mL和100 μg/mL的混合内标工作液，冷藏保存。

1.5 样品处理方法 吸取50 μL血清样本于1.5 mL塑料离心管中，加入10 μL内标工作液(1 μg/mL)，再加入240 μL甲醇溶液，在全自动样品冷冻研磨仪中研磨120 s。于-20 ℃静置20 min后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液至1.5 mL塑料离心管中。在沉淀物中再加入240 μL甲醇溶液进行提取、研磨与离心。合并2次上清液，氮气吹干，再以100 μL 50%甲醇-水复溶，涡旋后于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清至进样小瓶中待上机分析。

1.6 结果计算 按照以下公式计算饲料样品中各种胆汁酸的含量。

X=c×2

式中：X为血清中某种胆汁酸的含量(ng/g)；c为由标准曲线得到试液中某种胆汁酸的浓度(ng/mL)。

1.7 方法验证

1.7.1 标准曲线与线性范围 按选定的色谱条件对已配制的胆汁酸混合标准工作溶液进行上机检测，以各胆汁酸标准品溶液浓度为横坐标，以胆汁酸标准品溶液与内标的峰面积比值为纵坐标，进行权重回归。

1.7.2 添加回收试验 取空白小鼠血清样做回收试验，设置20、50 ng/mL和200 ng/mL三个添加浓度的胆汁酸同位素内标混合标准工作溶液，每个添加浓度设置3个平行测定，按1.5方法进行样品预处理，上机检测，测定胆汁酸的回收率。

1.7.3 实际样本的检测 采集6只C57BL/6J小鼠血清于无抗凝剂的采血管中，编号1～6，静置后于4 ℃、3 000 g离心10 min分离血清，采用所建的LC-MS/MS法检测小鼠血清样品中的胆汁酸含量。

2 结果

2.1 标准曲线与线性范围 结果如表1所示，TLCA、GLCA的线性范围为0.7～1 000 ng/mL，TCDCA、TDCA、TUDCA、THDCA、GCA、GCDCA、GDCA、GUDCA、Gβ-MCA和Gγ-MCA(GHCA)的线性范围为0.9～1 000 ng/mL，CA的线性范围为1.1～1 000 ng/mL，CDCA、DCA的线性范围为1.8～1 000 ng/mL，UDCA、α-MCA、β-MCA、γ-MCA(HCA)和ω-MCA的线性范围为2.2～1 000 ng/mL，HDCA、TCA、Tα-MCA、Tβ-MCA、Tγ-MCA(THCA)、Tω-MCA和GHDCA的线性范围为3.3～1 000 ng/mL，LCA的线性范围为5.0～1 000 ng/mL；浓度与峰面积的比值具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99；以信噪比(S/N)为3和10作为最低检出限和定量限，各胆汁酸的检测限在0.2～1.5 ng/mL，定量限在0.7～5.0 ng/mL。

表1 各胆汁酸的检测限、定量限、线性范围和相关系数Table 1 Detection limit,quantitation limit,linear range and correlation coefficient of bile acids

续表

典型胆汁酸标准溶液的多反应监测MRM色谱图如图1所示，在本研究所建LC-MS/MS方法下，各胆汁酸的峰形较稳定，周围杂质峰干扰少，有良好的分离效果，可准确定量检测各胆汁酸的含量。

图1 典型胆汁酸的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of typical bile acids

2.2 添加回收试验 由表2可知，用所建的LC-MS/MS方法进行胆汁酸同位素内标的添加回收试验，各胆汁酸同位素内标均可达到较稳定的回收率，平均加标回收率均在83.5%～108.4%，变异系数均小于14.9%。

表2 小鼠血清中胆汁酸的添加回收率和变异系数 Table 2 Recovery and coefficient of variation of bile acids in mouse serum (%)

续表

2.3 小鼠血清样品的检测 小鼠血清样品检测结果如表3所示，样本中所有胆汁酸分离良好，峰形稳定；小鼠血清中可检测出25种胆汁酸，主要以牛磺酸结合形式存在，且有较高含量的CA。

表3 小鼠血清胆汁酸谱 Table 3 Bile acids profile in mouse serum (ng/mL)

3 讨论

为了获得各胆汁酸色谱图的最佳分辨率和峰形，研究中通常采用固相萃取法和蛋白沉淀法作为血清胆汁酸测定的前处理方法，本研究选用甲醇沉淀血清蛋白，与Han等[13]采用的固相萃取前处理方法相比，甲醇提取方法操作简单快速，且可用于大批量科研样本的检测。本研究初期采用甲醇沉淀蛋白，发现提取1次后的沉淀物中仍有胆汁酸残留，因此对前处理方法进行优化，将提取次数增为2次，通过添加回收试验验证该法测定28种胆汁酸的平均加标回收率均在83.5%～108.4%，变异系数均小于14.9%，完全满足对小鼠血清胆汁酸代谢谱准确定量的分析需求。

本研究对流动相组成、流速及柱温进行优化，发现以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈作为流动相，在流速为0.5 mL/min，柱温65 ℃时获得较好的色谱峰形和保留时间。本研究大多数胆汁酸母离子/子离子离子对与Krautbauer等[14]所报道的及预期的胆汁酸产物离子一致。通过比较250～380 V不同破裂电压的响应值，发现在380 V时，各胆汁酸响应值处于较高水平，因此将破裂电压设置为380 V。在优化的破裂电压下对碰撞能进行进一步优化。碰撞能较低时，即在30 eV时游离胆汁酸的产物离子被检测到，为去质子化离子；碰撞能在74～80 eV时牛磺酸结合型胆汁酸被检测到；碰撞能在38～42 eV时甘氨酸结合型胆汁酸被检测到。国内有研究报道建立了检测人体和小鼠血清样本中15种胆汁酸的测定方法[15-16]。国外也有文献报道建立了可以检测19种[17]和21种[18]胆汁酸的方法。本研究所建立的方法在23 min内即可完成28种游离型和结合型胆汁酸的同步测定，检测的胆汁酸种类超过了上述研究。经本研究验证，28种胆汁酸检测限在0.2～1.5 ng/mL，定量限在0.7～5.0 ng/mL，在线性范围内线性良好，较广的线性范围有助于将此方法拓展到其他种类样本(如粪便、胆汁和组织等)中胆汁酸的测定，较丰富的胆汁酸种类可以满足研究对于常见胆汁酸的检测研究。本研究采用与待测胆汁酸理化性质相近的多种同位素标记胆汁酸作为内标，可对样品前处理和质谱分析过程中的误差进行校正。相较于罗镧等[19]采用的氯霉素内标，同位素内标得出的检测值相对准确。Zheng等[20]研究发现，小鼠胆汁中的主要胆汁酸为TCA、Tα-MCA、Tβ-MCA和TDCA。与之一致的是，本研究采用所建立的LC-MS/MS法检测出小鼠血清的25种胆汁酸，也是主要以牛磺酸结合形式存在，TCA、γ-MCA、Tβ-MCA具有较高的水平。本研究推测，肠道微生物对甘氨酸结合型胆汁酸的水解速度高于对牛磺酸结合型胆汁酸的水解速度可能是牛磺酸结合型胆汁酸比例占优势的原因。

综上可知，本研究建立的基于同位素内标的LC-MS/MS检测方法可同时检测28种胆汁酸，能够用于小鼠血清胆汁酸谱的测定。该方法前处理操作方便快捷，灵敏度和特异性较高，对某些疾病的早期无创诊断具有重要意义。