固本健脑液对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及睡眠时相的影响

毛剑琴 张誉丹 曾楚华 袁德培

(湖北中医药大学基础医学院，武汉，430065)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)发病症状呈持续性的脑部神经系统衰退，被普遍认为是海马型遗忘综合征，属于痴呆症最常见的病因之一，在全球范围内占痴呆病例的50%～75%[1-2]。而全球人口老龄化发展也进一步促进了我国AD的患病率不断上升，给家庭与社会带来沉重经济负担的同时，也成为广泛关注的医学性问题。研究表明，不同程度的昼夜节律紊乱在AD患者和相关AD动物模型中均有体现，其中就包括行为学上的睡眠-觉醒节律紊乱、静息-活动节律紊乱，也存在机体的一些激素的昼夜节律紊乱，AD患者的长期昼夜节律紊乱也可导致AD的病理进程加快，已证实约有44%的AD患者伴发有睡眠障碍[3-4]。而导致这一结果的发生正是由于在衰老过程中昼夜节律往往最先受累，因此在AD的发病过程中表现尤为突出[5]。国外学者也指出AD病情发展与睡眠障碍相关，并且睡眠障碍可能是导致AD的重要病因[6]。由AD导致机体静息-活动昼夜节律紊乱是AD患者经常伴发的症状之一。因此，本实验建立AD大鼠模型，并通过中药固本健脑液予以干预，以期探讨固本健脑液改善AD模型大鼠的昼夜节律紊乱。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 40只无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级雄性SD大鼠[海南医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(琼)2019-0001]，体质量220～250 g，在指定条件下，室内温度20～25 ℃；噪声≤55 dB(A)；相对湿度：(55±15)%；光照强度：300 Lux，光照节律：07:00-19:00光照，19:00-07:00黑暗，明暗交替，于动物笼中适应性饲养1周后开始实验。本实验经过医院伦理学委员会批准进行，各实验操作均符合医学伦理学要求(伦理审批号：2021-009)。

1.1.2 药物 固本健脑液是由恩施板桥党参15 g、枸杞子15 g、茯苓15 g、酸枣仁12 g、山楂12 g组成，购买于湖北民族大学附属民大医院，加入6倍量水后煎煮2次，滤出药液(该过程重复2次)，将2次滤出来的药液充分混匀，将其用旋转蒸发仪高温加热浓缩成每毫升含生药2 g的药液，置于4 ℃冰箱内保存备用。褪黑素购于上海麦克林生化科技有限公司，生产批号:C13143553。超声溶解混匀于纯净水中，实验动物按0.09 mg/(kg·d)标准灌胃。

1.1.3 试剂与仪器 β淀粉样蛋白1-42(β-amyloid Protein，Aβ1-42)(武汉艾迪抗生物科技有限公司，批号：AD21893)；10%水合氯醛(天津市光复精细化工研究所，批号：20190401)；牙科水泥(上海玉研科技有限公司，批号：191009)；牙科水泥自凝水(上海玉研科技有限公司，批号：190326)；注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂，批号：A190403015)；旋转蒸发仪(上海圣科仪器设备有限公司，型号：RE 2000A)；电子分析天平(梅特勒赛多利斯科学仪器有限公司，型号：BS110S型)；冰箱(深圳市宝安区沙井广氏电器厂，型号：BCD-629WDEYU1)；动物行为检测系统(Clever Sys公司，美国，型号：HomeCageScan3.0)、睡眠生物解析系统(Biotex Kyoto公司，日本，型号：VitalRecorder3.0)、动物睡眠分析软件(Kissei Comtec株式会社，日本，版本号：Sleepsign3.0)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将40只SPF级雄性SD大鼠随机分为4组，即空白对照组、模型组、固本健脑液组、褪黑素组，每组10只。大鼠适应性喂养7 d后开始建立AD模型，除空白对照组外。具体操作如下：取大鼠称取体质量后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取脑立体定向仪固定大鼠，刮掉头顶毛发后碘伏(河南华凯生物科技有限公司，批号：20210302)消毒，沿颅骨正中切开，分离皮下组织和筋膜，参照脑立体定位仪，以前囟“十”字缝中心点为零点，正中线向后4 mm，矢状线左右各3 mm，标记位置，钻孔后微量进样器吸取2 μL Aβ1-42，注射后停留针头2 min，慢慢取出针头，对侧行同样操作。大鼠注射结束后，缝合头皮，伤口处用碘伏消毒，棉签涂抹马应龙痔疮膏(马应龙药业集团股份有限公司，批号：20210118)，每只肌内注射4万U青霉素钠预防感染。待大鼠苏醒后放回笼中，记录造模日期。空白对照组同上位置注射0.9%氯化钠溶液(四川科伦药业股份有限公司，批号：L212062101)，其余操作相同。

1.2.2 给药方法 固本健脑液组予以剂量为16 g/(kg·d)固本健脑液灌胃；褪黑素组予以给药剂量0.09 mg/(kg·d)。共灌胃8周，空白对照组及模型组以等量0.9%氯化钠溶液胃。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 Morris水迷宫行为学测定 用几滴食用色素使池水变黑，然后将水深保持在31.5 cm，温度保持在(23±1)℃，在水面以下设置1.5 cm圆形透明有机玻璃平台，用虚线将池划分为4个相等的象限，以进行描述性数据收集，将隐藏平台放置在水迷宫的第三象限(Q3)，提捏大鼠尾部将其面向池壁分别从4个象限的固定位置进入水中，通过摄像机在连接到基于计算机的图形分析软件的水迷宫上捕捉大鼠的游泳行为，记录大鼠寻找到第三象限平台的逃潜伏期，并计算其平均隐藏潜伏期[7]。

1.2.3.2 大鼠昼夜节律检测 采用HomecageScan 3.0实时监测系统检测各组大鼠在笼内的所有周期性刻板样行为并进行分析，观察时间为24 h。操作前先按该软件系统的说明对大鼠的居家笼光照及黑暗背景进行保存，对笼内前后上下左右及边框的高度进行准确的设置与描绘，并对垫料的高度以及饮食饮水等活动区域皆进行设置，然后将各组大鼠随机放置笼内允许自由活动。系统通过红外线热成像探测及视频轨迹追踪，通过摄像头识别记录20多种复杂的行为如：睡、睡醒、理毛、吃、喝、嚼、跳、扭动、嗅、挠、站、蹲、攀、走、跑、落地、转圈、挖、掘、暂停、伸展身体、连续跳动、小便等的次数来进行时空序列分析，以此判定老年失眠大鼠模型复制成功，其中前12 h是日间模式，后12 h为夜间模式。

1.2.3.3 大鼠电极埋置术 手术埋置记录电极前禁食24 h，10%水合氯醛(360 mg/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠头颈部毛发剃净，将大鼠固定于脑立体定位仪，切开颅顶皮肤，露出颅骨前后囟并使用0.9%氯化钠溶液冲洗。按照参考文献[7]进行定位，分别在颅骨上前/后囟前2 mm，中线右侧旁开2～3 mm处以0.8 mm钻头钻孔，在钻通颅骨又未触及脑组织后停止，安装脑电记录电极螺丝，将螺丝固定好后用来记录脑电图(Electroencephalograhpy，EEG)；在囟门前2 mm，以中间线左侧2～3 mm处钻孔，不直接进入穿破颅骨，并安装参考电极螺丝，将螺丝固定后，将用来记录肌电图(Electromyogram，EMG)的2根无菌导线直接插入头后颈肌，用牙科水泥固定凝结后缝合伤口。术后将实验大鼠单笼置于睡眠生物分析系统中，肌内注射青霉素钠4万U预防感染，连续注射3 d，大鼠恢复2周。在恢复期结束时，将大鼠头部电极插座连接到脑电/肌电信号插头，再连接到多通道万向轮。通过记录线将信号连接到放大器，对信号进行滤波(EEG,0.5～30 Hz；EMG,20～30 Hz)经放大后输入计算机，经模数转换成最终的数字信号。训练结束后在实验环境实行明暗(L/D:12 h/12 h)光照周期处理，随后描记脑电和肌电，记录时间为7：00至次日7：00，连续记录24 h。

1.3 脑电肌电记录及分析 固本健脑液治疗后记录大鼠EEG/EMG，大鼠的脑电及肌电信号由记录导线接入放大器，由睡眠生物解析系统放大、滤波至电脑数模转换后，用Sleepsign软件进行独立记录和分析，记录后，每10秒作为分析单元进行自动扫描，以统一标准区分觉醒(Wake)、快速眼球运动(Rapid Eye Movement，REM)和非快速眼动(Non-rapid Eye Movement，NREM)睡眠，一旦分析和扫描完成，就需要人工检查，并在必要时进行适当的纠正。

图1 睡眠时相的解析原理

2 结果

2.1 固本健脑液对大鼠学习记忆能力的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，目标象限游泳时间百分比显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，所有观察组逃避潜伏期显著缩短，目标象限游泳时间百分比显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期及目标象限游泳时间百分比比较

2.2 HomeCage监测睡眠情况 与空白对照组比较，模型组睡眠觉醒次数多(P<0.05)，睡眠持续时间显著性降低(P<0.05)且昼夜节律颠倒；与模型组比较，固本健脑液组睡眠觉醒次数减少(P<0.05)，睡眠持续时间较长(P<0.05)且睡眠昼夜节律正常；而褪黑素组则表现为虽有觉醒次数减少(P<0.05)，但睡眠总时长延长(P<0.05)，失去昼夜节律。见图2～3。

图2 各组大鼠生物节律行为次数

图3 大鼠睡眠持续时间

2.3 Sleepsign脑电肌电描记结果 与空白组比较，模型组白天觉醒累积量明显增高(P<0.05)，觉醒次数显著增多(P<0.05)，REM睡眠累积量明显降低(P<0.05)，夜间NREM睡眠显著降低(P<0.05)；褪黑素组白天睡眠累积量无显著差异，睡眠持续时间显著升高(P<0.05)，REM睡眠累积量明显降低(P<0.05)，夜间NREM睡眠累积量明显增多(P<0.05)；固本健脑液组与空白组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图4～5。

图4 各组睡眠-觉醒时辰变化示意图

图5 各组大鼠NREM,REM和觉醒量的比较图

3 讨论

大量研究发现睡眠节律障碍与AD存在密切的相互作用[8-10]。有研究表明，通过对AD模型鼠进行慢性睡眠剥夺可加速AD鼠脑内的Aβ异常沉积，从而使得学习记忆障碍加重[11]。由此推测睡眠节律紊乱可能造成脑组织内Aβ异常沉积，促进AD的发病进程。AD患者脑组织内存在大量的炎症反应，脑组织内炎症反应能够抑制神经元新生、加速神经元丢失，进一步加重脑组织损伤[12]，这种睡眠障碍与AD之间的关联性也为研究AD的发病机制提供了新的思路。另外有研究表明，睡眠是调节学习记忆和情绪调节的重要脑部活动[13]，而睡眠障碍则会导致记忆功能减退、认知能力降低，从而增加AD患病的可能性[14]，并且大部分AD患者均存在不同程度的睡眠节律紊乱情况。固本健脑液是具有健脑安神功效的一种方剂，能补脾肾之虚，固人体精气血之本，从而健脑安神，结合古今医家对失眠发生病因病机的认识，认为老年失眠主要是脾肾等脏腑虚衰，气血不足所致，所以其治疗也当以补肾健脾，以养精气血之本，使脑健神安为主，故用本方以达固本健脑之功。亦有早期研究提示汤剂能够明显改善AD模型鼠的睡眠障碍及学习记忆能力[15]，本研究在此基础上进一步对其作用机制进行分析。

AD是一种不可逆转的认知损害，也是最常见的痴呆症类型。在进行性认知障碍的同时，昼夜节律紊乱也在AD的进展中起着关键作用[16]。这种昼夜节律的紊乱可发生在AD的早期阶段，也可随着疾病的发展，在AD晚期发生更加严重的睡眠-觉醒周期紊乱[17]。研究发现，AD小鼠存在不同程度的睡眠异常：8周龄Tg2576小鼠睡眠正常，但发现其24周龄时存在快速眼动睡眠时长减少的现象，且随着月龄的增长加重[18-19]。APP/PS1小鼠也可表现出睡眠脑电图以及睡眠-觉醒周期异常[20]。另一方面，睡眠障碍也可成为导致或加重AD的危险因素[21]，已有研究发现，对AD小鼠的慢性睡眠剥夺，不仅导致了Aβ沉积的加快，也可使突触损伤导致学习记忆能力下降更为严重[22]。以上都是昼夜节律系统的紊乱和AD发病机制中具有的共同的特征及致病因素，这也揭示了将它们作为一条相互依赖的途径进行研究的前景。

综上所述，可以得知固本健脑液对于昼夜节律与AD的交互作用研究具有一定意义，有望为AD相关昼夜节律紊乱机制的深入研究提供新的治疗思路。改善睡眠质量恢复昼夜节律对于AD患者来说可能不再仅仅是对症治疗，而极有可能成为针对AD病因进行防治的有效方法。