健脾益气摄血方对原发免疫性血小板减少症模型小鼠凝血功能的影响

严 香 赵 倩 陈信义 张雅月

(北京中医药大学东直门医院，北京，100700)

原发免疫性血小板减少症(Primary Immune Thrombocytopenia，ITP)是一种自身免疫性疾病，发病机制尚未明确，目前认为ITP的发病是由于体液免疫和细胞免疫介导的血小板过度破坏，以及巨核细胞数量和质量异常，导致血小板清除增强和生成受损而导致血小板计数降低[1]。基于中医基础理论及辨证论治原则，脾脏能统摄血液在经脉之中而不逸出脉外，因此ITP病因病机与脾气亏虚、脾不统血关系密切，从而确定“从脾论治”ITP基本原则[2-3]，以健脾益气摄血为治法，拟定健脾益气摄血方。在前期研究中，我团队实验表明健脾益气摄血方在升高ITP患者及动物血小板数值、改善出血症状方面疗效尚佳[4-5]，其效应机制可能与调控凝血过程有关[6-7]。止血生理过程包括血管内皮、血小板聚集黏附和凝血功能之间的复杂相互作用[8]。因此本研究从凝血角度出发，以出血程度、凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT)、活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)、纤维蛋白原(Fibrinogen,FIB)为观察指标，探讨健脾益气摄血方对ITP模型小鼠凝血功能的影响，为ITP的中医药治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 豚鼠100只，雌雄各半，体质量250 g，许可证号：SCXK(陕)2012-001，购于陕西省兴平市天瑞实验动物养殖场，普通环境饲养，室温20～25 ℃，相对湿度50%～60%；BALB/c小鼠260只，雌雄各半，体质量18～22 g，许可证号:SCXK(陕)2014-002，购于中国人民解放军第四军医大学实验动物中心，无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级动物实验室饲养，室温20～25 ℃，相对湿度50%～60%。本研究经陕西省西安医学院动物伦理委员会审批(伦理审批号：XYLS2019069)。

1.1.2 药物 泼尼松(上海晶纯生化科技股份有限公司，货号：P116562)。实验用中药浸膏由西安星华药物研究所按照中药新药药学标准制备并提供，包括:非从脾论治浸膏(穿山龙、三七)。健脾益气摄血浸膏(黄芪、党参、茯苓、白术、阿胶、茜草、炙甘草)。

1.1.3 试剂与仪器 完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，美国，批号:SLBF2619V)，不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，美国，批号:SLBH7317V)，生理盐水(双鹤药业，批号：Y201407154W)，乙醚(Merck,美国,批号：100930)；CA-1500型全自动血液凝固分析仪(Sysmex，日本，型号：CA-1500型)，全波长酶标仪(赛默飞科技公司，美国，型号:Multiskan GO no.51119300)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 取160只BALB/c小鼠，乙醚麻醉后，从小鼠心脏取全血，以乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝，分离血小板并洗涤，用生理盐水稀释。取已分离的血小板分别与等量完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂混合成油包水状作抗原，以含完全福氏佐剂抗原于0周注射100只豚鼠足掌、背及皮下，至少4点；以含不完全福氏佐剂抗原分别于1、2、4周按上述相同部位与点数注射。第5周从豚鼠心脏取不抗凝全血，560×g，离心10 min后取上清液，即得血小板糖蛋白血清(Glycoprotein-antiplatelet Serum,GP-APS)，并贮存于-20 ℃冰箱待用。将APS从-20 ℃中取出，置56 ℃水浴30 min，用等量BALB/c小鼠红细胞吸附至少2次，用生理盐水稀释成1∶4浓度APS备用[9]。从100只BALB/c小鼠尾静脉取血，用全自动血液分析仪检测血小板计数，并随机分为正常组、模型组、泼尼松组、非从脾论治组、健脾益气摄血组5组，每组20只。除正常组按100 μL/20 g生理盐水腹腔注射外，实验各组按100 μL/20 g剂量注射APS，1次/d至实验结束。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算相应样品浓度。依据病证结合模型辨识标准判定造模是否成功[10]。APS血清组OD值平均为0.300，空白孔OD值平均为0.163，相差约2倍(P<0.01)，造模成功。

1.2.2 给药方法 造模成功后第8天，正常组、模型组小鼠给予生理盐水0.1 mL/10 g体积灌胃，泼尼松组给予浓度为2 mg/mL泼尼松溶液0.1 mL/10 g灌胃，中药组均按照0.1 mL/10 g体积灌胃给药。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 出血程度分级 参照中华医学会血液病分会2020年颁布的指南中出血评分标准，结合动物实验特点，拟定出血程度分级标准并进行动态观察[11]。出血程度分级标准：0级为无出血现象；Ⅰ级为注射部位轻度出血，其他部位有散在出血点；Ⅱ级为注射部位明显出血，并见有其他部位瘀斑、瘀点；Ⅲ级为注射部位严重出血，皮肤大量瘀斑、瘀点，或皮肤发黑或破溃。注意在观察出血程度时，要以出血面积与出血点密集程度描述，并关注出血部位、出血开始时间、止血时间、出血色泽、形状等。观察时间点为第8天(用药前)、第10天(用药第2天)、第12天(用药第4天)、第14天(用药第6天)、第16天(用药第8天)共5个时间点，从实验各组中随机选择10只小鼠动态观察出血程度变化情况。

1.2.3.2 全自动血液分析仪检测凝血功能 实验结束后，各组随机选取6只小鼠尾静脉取血。用全自动血液凝固分析仪检测PT、APTT、FIB。

2 结果

2.1 出血程度观察 在注射APS后第3天ITP模型小鼠皮下可见密集的鲜红出血点，如腹部、四肢、耳缘处，部分瘀斑融合成片，持续时间3～4 d。见图1。

图1 模型小鼠出血情况

2.2 出血程度比较 给药前，与正常组比较，各组出血程度显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；模型组、泼尼松组、非从脾论治组、健脾益气摄血组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明注射GP-APS后各组小鼠均有相似程度的出血倾向，组间具有可比性。

药物干预第2天，与正常组比较，模型组小鼠出血程度差异有统计学意义(P<0.05)；模型组及泼尼松组、非从脾论治组、健脾益气摄血组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

药物干预第4天，与正常组比较，模型组小鼠出血程度差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，泼尼松组、非从脾论治组、健脾益气摄血组小鼠出血程度开始降低，表现出向0级与1级趋势，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。

药物干预第6天，各组出血程度比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，泼尼松组、健脾益气摄血组出血程度明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与非从脾论治组比较，健脾益气摄血组差异无统计学意义(P>0.05)。

药物干预第8天，各组小鼠出血程度组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，泼尼松组、健脾益气摄血组出血程度改善，差异有统计学意义(P<0.01)；与非从脾论治组比较，健脾益气摄血组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠不同时间点出血程度比较(n=10)

2.3 各组PT、APTT和FIB比较 与正常组比较，模型组小鼠PT、APTT显著升高，FIB水平下降，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，泼尼松组与健脾益气摄血组PT、APTT明显下降，FIB上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，非从脾论治组PT、APTT下降，FIB上升，差异无统计学意义(P>0.05)。3)与泼尼松组比较，健脾益气摄血组PT、APTT、FIB差异无统计学意义(P>0.05)。与非从脾论治组比较，健脾益气摄血组PT、APTT表达明显下降，FIB水平上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 各组小鼠PT、APTT和FIB比较

3 讨论

ITP是一种自身免疫性疾病，其特征是由于血小，清除增强和生成受损而导致血小板计数降低。ITP的临床表现因患者而异，出血是最常见的表现，如皮肤、口腔、胃肠道出血或颅内出血等[12-13]。在中医学中，ITP属“血证”“虚劳”“紫斑”等范畴，现统一命名为“紫癜病”[14]。明代御医薛立斋是最早提出“脾统血”思想的医家，他指出：“心主血，肝藏血，亦能统摄于脾，补脾与胃，血自生矣。”[15]“脾主统血”是指脾有统领与固摄血液在脉道中常态运行，不逸出脉外的生理功能，其内涵实质是“脾气健旺，运化有常”。反之即是“脾不统血”的病理现象，其发病机制是脾气虚弱进一步加重或恶化的病理过程或结局，外在表象是“慢性出血”伴随脾气虚弱症状。中医学中“血”是营养人体脏器组织，维持生命活动的红色精微物质，而通过现代医学手段观测，血是指人或动物体内循环系统的不透明液体，主要包括血浆、血细胞、凝血因子等成分。团队前期研究表明健脾益气摄血方能够改善ITP患者出血症状，提高血小板计数，调控血管活性因子[6-7]，提示上述血液成分可能是脾统血功能发挥的对象。因此拟定健脾益气摄血方，验证“从脾论治”ITP的基本治法。

方中黄芪性温味甘，归脾、肺经，功效健脾益气固表，此外临床所见患者多表现为身体下部出血，故亦取其益气升提之长，为君药。党参、茯苓、白术3药为臣，取四君子汤之意，加强组方健脾益气之力。茜草味苦性寒，归肝经，可祛瘀通经、凉血止血，阿胶味甘平，归肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥的功效；二者共为佐药，既增加止血作用，又可防止君臣补益太过而致血脉瘀阻或血热妄行，有摄血不留瘀、补血不动血之效。再加一味炙甘草为使药，益气和中、调和诸药[16-17]。阳性对照方面，泼尼松作为治疗ITP的一线用药，具有抗炎、调节免疫的作用[18]；非从脾论治组选用具有化瘀止血、活血通络功效的穿山龙、三七[19-20]。本研究中除正常组外，各组小鼠造模后出现相似程度的出血，药物干预第6天及第8天，与模型组比较，泼尼松组、健脾益气摄血组出血程度明显下降，提示泼尼松及健脾益气摄血方具有一定优势。

凝血过程是一种复杂的级联反应[21]。血管内皮细胞受损后，表达并释放组织因子(Tissue Factor,TF)，启动外源性凝血途径；基底胶原暴露，激活凝血因子Ⅻ(FⅫ)，启动内源性凝血途径。2种途径激活后，凝血过程进入共同途径，生成凝血酶。在凝血酶的作用下，纤维蛋白原形成稳定交联的纤维蛋白，以完成凝血过程。在研究中选取能够代表凝血功能的PT、APTT、FIB3个关键指标，其中，PT主要反映外源性凝血系统状态；APTT反映内源性凝血系统状态；FIB又称凝血因子I(FI)，是凝血过程的中心蛋白质[22]。本研究中，模型组小鼠PT、APTT显著升高，FIB水平下降，提示ITP模型小鼠可能存在凝血功能异常。经泼尼松及健脾益气摄血方干预后，小鼠PT、APTT明显下降，FIB上升，非从脾论治组无明显差异，提示泼尼松及健脾益气摄血方能改善ITP小鼠凝血功能，从脾论治ITP具有一定优势。

综上所述，健脾益气摄血方能明显改善ITP小鼠出血程度及凝血功能，充分说明“从脾论治的”有效性，提示凝血因子可能是脾主统血生理功能的物质基础。但本研究样本量较少，今后将通过扩大样本量进行验证；另外目前只初步探索了健脾益气摄血方对ITP模型小鼠凝血功能的影响，其具体调控机制有待进一步研究。