仙灵骨葆胶囊治疗绝经后骨质疏松症的生物信息学和网络药理学分析和实验验证

柴 爽 杨岩冰 马江涛 郭云鹏 滕军燕 秦 娜 张 虹

(河南省洛阳正骨医院/河南省骨科医院，郑州，450016)

骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)是一种以骨量低下，骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。PMOP分为原发性和继发性两大类，其中绝经后PMOP占比最大。调查显示，我国40～49岁人群PMOP患病率为3.2%，50岁以上人群PMOP患病率为19.2%[1]。世界卫生组织统计表明绝经后PMOP一般发生在女性绝经后5～10年内，在世界范围内，年龄超过50岁的女性中，每2名女性就有1名会受到骨质疏松性骨折的影响[2-3]。

PMOP最严重的后果是骨质疏松性骨折，至2050年我国的骨质疏松性骨折患病数可能高达599万人[4]。因此，重视PMOP的防治具有重大意义。中医药防治PMOP历史悠久[5]，仙灵骨葆胶囊(Xian-ling-gu-bao Capsule，XLGB，国药准字Z20025337)作为PMOP类处方药品被列入《国家基本药物目录》，被推荐用于绝经后PMOP[1]和老年PMOP[6]。XLGB药物组成包括淫羊藿、续断、补骨脂、熟地黄、丹参和知母，具有滋补肝肾，活血通络，强筋壮骨之功效。本研究采用生物信息学和网络药理学分析XLGB治疗绝经后PMOP的可能机制，并进行动物实验验证。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 数据库 高通量基因表达(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[7]和BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[8]。

1.2 方法

1.2.1 GEO芯片数据分析绝经后PMOP相关靶点 首先从GEO数据库中以“osteoporosis”为关键词，条目类型选择“Series”、研究类型选择“Expression profiling by array”,种属选择“Homo sapiens”进行搜索，得到GSE56815的芯片数据及其对应的分析平台文件GPL96。该芯片数据对具有高低不同骨密度的80名绝经前后女性血液单核细胞进行基因测序。其次利用Perl软件(V5.30.0)对芯片数据矩阵进行注释及分组，数据注释时将基因探针名改为相应的基因名，数据分组时将绝经前后高骨密度样本视为正常组40例，绝经前后低骨密度样本视为病例组40例。最后运用R软件及limma包和pheatmap包，对数据矩阵进行矫正及差异分析，得到GEO数据库差异火山图。其中筛选条件P值<0.05,差异倍数(Fold Change，FC)>1。

1.2.2 XLGB中活性成分的筛选及靶点预测 本研究首先检索可供查询中药、中药活性成分及相应靶点等信息的TCMSP和BATMAN-TCM数据库获得补骨脂、淫羊藿、续断、熟地黄、丹参、知母6味中药的活性成分及相应靶点。其中筛选条件为口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，药物类药性(Drug Likeness,DL)≥0.18[9]。然后采用Perl软件将中药活性成分与相应靶点进行一一映射，并为筛选出的靶点添加基因名。

1.2.3 XLGB调控网络的构建 将绝经后PMOP疾病靶点和XLGB活性成分靶点利用Perl软件进行一一映射，得到中药活性成分与疾病的共同靶点，然后利用Cytoscape软件(V3.7.1)进行网络可视化，得到活性成分-靶蛋白调控网络。其中节点的类型有活性成分、靶点。

1.2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建和关键靶点筛选 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络的构建主要利用Cytoscape软件的Bisogenet插件，关键靶点筛选利用Cytoscape软件的CytoNCA插件。将1.2.3得到的活性成分与疾病的交集靶点利用Cytoscape软件的Bisogenet插件绘制PPI网络。由于所得PPI网络庞大，因此利用Cytoscape软件的CytoNCA插件进行网络拓扑分析，以便筛选关键靶点。其中筛选条件为自由度(Degree，DC)>61，中心中介性(Betweenness，BC)>600[9]。“节点”(Node)表示基因，“边”(Edge)表示基因之间的相互关系，连接边越多的节点，表明这个节点在网络中越重要。

1.2.5 XLGB活性成分和疾病共同靶点的富集分析 利用R语言计算1.3得到的XLGB活性成分与绝经后PMOP的共同靶点，得到基因本体(Gene Ontology，GO)生物过程富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。以P<0.05为差异有统计学意义。然后利用Cytoscape软件将共同靶点和显著富集的KEGG通路进行网络可视化分析。GO功能富集分析主要包括生物过程(Biological Process,BP)，细胞组分(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)3部分。

1.3 动物实验验证

1.3.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级12周龄雌性SD大鼠32只，购自河南省实验动物中心，合格证号SCXK(豫)2017-0001。所有实验方案均经河南省洛阳正骨医院动物实验伦理委员会批准。

1.3.2 药物 XLGB(国药集团同济堂制药有限公司，国药准字Z20025337)，戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司，国药准字J20171038)

1.3.3 试剂与仪器 BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western及免疫沉淀裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0010、P0013B)，大鼠血清活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号：S003S)，TUNEL试剂盒(Roche，瑞士，批号：11684817910)，B细胞淋巴瘤-2(B-cell-2,Bcl-2)和Bcl-2对抗杀手蛋白(Bcl-2-antagonist/killer Protein，Bak)抗体(CST，美国，批号：2870和12105)，β-actin抗体、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，批号：20536-1-AP、SA00001-2-500和SA00001-1-500)。

1.3.4 分组与模型制备 将32只大鼠随机分为假手术组，模型组，XLGB组，戊酸雌二醇组4组，每组8只，采用去卵巢法造模。

1.3.5 给药方法 造模术后1个月灌胃给药，给药剂量按照人与大鼠体表面积折算，戊酸雌二醇组给药剂量为0.104 mg/kg，XLGB组给药剂量为0.25 g/kg，假手术组和模型组给予等体积生理盐水，灌胃3个月后收集标本。

1.3.6 检测指标与方法 检测大鼠腰椎骨密度，取大鼠血清检测活性氧水平，取右侧股骨远端进行TUNEL染色，左侧股骨远端提取总蛋白，采用蛋白质免疫印迹法检测Bcl-2、Bax表达。

2 结果

2.1 PMOP靶点的筛选 利用GEO芯片数据，进行绝经前后高骨密度样本组和绝经前后低骨密度样本组基因的差异表达分析，共发现883个基因存在组间差异表达，其中表达上调基因424个，表达下调基因459个。见图1。

图1 差异表达基因的火山图

2.2 XLGB活性成分的筛选及靶蛋白预测 共获得119种活性成分，其中淫羊藿活性成分23种、续断活性成分8种、补骨脂活性成分6种、熟地黄活性成分2种、丹参活性成分65种、知母活性成分15种。共收集活性成分所对应的靶蛋白1 734种。

2.3 XLGB活性成分-共同靶点调控网络 将PMOP靶点与XLGB活性成分对应的靶蛋白取交集后得到26个共同靶点，所对应的XLGB中活性成分共61种。其中，淫羊藿活性成分7种、续断活性成分1种、补骨脂活性成分3种、丹参活性成分43种、知母活性成分3种，多味中药(2味及以上)共有的活性成分4种。见图2。

图2 XLGB活性成分-靶蛋白调控网络

2.4 共同靶点PPI网络的构建和关键靶点筛选 共得到3 916个节点和69 974个边，这表明XLGB可能影响3 916个与PMOP相关的基因，而这3 916个基因之间可以产生69 974种直接或间接的相互作用。设置DC>61，BC>600，得到152个节点和3 832个边。表明XLGB可能影响与PMOP相关的152个基因。见图3。

图3 XLGB调控PMOP的关键靶点

2.5 XLGB活性成分和疾病共同靶点的富集分析 如图4所示，显著富集到BP的GO条目有调控结合与负调控结合，细胞氧化应激反应，对营养水平的反应，调控膜电位，巨噬细胞源性泡沫细胞分化，泡沫细胞分化，兴奋性突触后电位，神经元死亡等。

图4 XLGB活性成分和疾病共同靶标的基因本体论

显著富集到CC的GO条目有分泌性颗粒、胞质囊腔、囊腔、肽酶复合物、膜筏、膜微结构域、膜区、纺锤体、特殊颗粒等。显著富集到MF的GO条目有蛋白激酶C结合、辅因子结合、BH域结合、死亡域结合、酰胺结合、硫化物结合、脂肪酰辅酶A结合、脂肪酸衍生物结合、胆固醇结合等。如图5所示，显著富集的信号通路包括细胞凋亡信号通路，破骨细胞分化信号通路，cAMP信号通路，MAPK信号通路，细胞衰老信号通路，cGMP-PKG信号通路，VEGF信号通路，寿命调节信号通路，内分泌抵抗信号通路，HIF-1信号通路等。然后，利用，共有15个共同靶点通过调控13个信号通路来影响PMOP的发生。其中，AKT1、JUN、NFKB1，NFKBIA、PPP3CA、BAX等靶点的作用较大。见图6。

图5 XLGB活性成分和疾病共同靶点的KEGG通路富集分析

图6 XLGB活性成分-信号通路网络

2.6 XLGB对去卵巢大鼠细胞凋亡的影响 综合上述分析，动物实验重点关注XLGB对PMOP细胞凋亡的影响。如表1所示，腰椎骨密度结果显示2种药物干预后，均可明显改善去卵巢引起的骨密度降低(P<0.05)，与假手术组比较，OVX组活性氧水平显著升高(P<0.05)，药物干预后，戊酸雌二醇组血清雌激素水平有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，XLGB组活性氧水平明显降低(P<0.05)。

表1 XLGB对骨密度、血清活性氧的影响

对股骨远端骨组织进行TUNEL染色及凋亡率测定，模型组TUNEL阳性细胞增多，药物干预后各组TUNEL阳性细胞显著减少(P<0.05)。模型组Bcl-2水平降低(P<0.05)，Bax升高(P<0.05)。药物干预后，与模型组比较，XLGB组和戊酸雌二醇组Bcl-2水平显著增加，Bak水平显著降低(P<0.05)。见图7。

图7 仙灵骨葆胶囊对细胞凋亡的影响

3 讨论

中医学将PMOP归属为“骨痿”范畴，最新的中医药专家共识认为PMOP主要是由于绝经后妇女肾精不足等因素导致骨失滋养的全身性慢性骨骼疾病[1]，是一种与增龄相关的疾病。女子七七之后，人的体质特点以任脉虚，太冲脉衰少，精少，肾脏衰，天癸竭之“虚”象和地道不通，形体皆极之“瘀”象为主，此时发为本病多为本虚标实之证，病变脏腑为脾、肝、肾，气滞血瘀为其表证。医家对本病的中医病机辨证，多从肾虚、脾虚、血瘀进行辨证，或以肾虚为主，兼顾脾虚、血瘀，或分而论治。常用辨证分型为脾肾阳虚证、肝肾阴虚证和肾虚血瘀证，对于脾肾阳虚证，治宜温补脾肾，强筋壮骨，专家共识推荐使用XLGB加文献。临床实践表明XLGB治疗PMOP在改善腰椎骨密度、提高临床有效率及改善疼痛方面疗效确切，同时，XLGB联合单一抗骨质疏松药物具有增效作用，而其与2种或以上抗骨质疏松药物联用叠加增效作用尚待研究[10]。

近年来，开展了许多XLGB治疗PMOP的基础研究，发现XLGB可通过调节骨形成蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein，BMP)-2、BMP-4、蛋白激酶C和转化生长因子β1来提高去卵巢大鼠骨密度[11]，可通过提高去卵巢大鼠股骨骨折周围软组织血小板衍生生长因子、转化生长因子β-β和血管内皮生长因子进骨折愈合[12]，可显著降低骨周转率、促进成骨及抑制脂肪生成、促进骨小梁结构改善[13]，可能通过参与去势大鼠组蛋白修饰改善PMOP症状。但这些研究仅从单一方面关注XLGB的可能作用机制，未进行其物质基础的探索。本研究采用生物信息学和网络药理学的方法，筛选PMOP相关差异表达基因，对XLGB的有效活性成分进行筛选，并预测可能的作用靶点，对共同靶点进行网络构建和富集分析，以期阐明XLGB治疗PMOP的靶点和作用机制。

利用生物信息学方法挖掘GEO芯片数据，共发现883个与PMOP发生发展相关的靶点。通过检索TCMSP和BATMAN-TCM数据库，共获得XLGB的119种活性成分，将疾病相关靶点与活性成分对应的靶蛋白取交集后得到26个共同靶点，共对应61种XLGB活性成分，调控网络图说明XLGB中的61种活性成分可以单独或共同作用于影响PMOP发生的26种基因中的一个或多个，对这些共同靶点进行PPI网络分析发现其与PMOP相关的152个节点PPI，表明XLGB可能间接通过影响这些蛋白质发挥抗PMOP的作用，这些可以解释中草药的多效性，体现了中药“多组分、多靶点”的作用机制[14]。

对共同靶点的GO富集分析显示，XLGB调控PMOP相关靶蛋白主要富集在细胞氧化应激反应，对营养水平的反应，分泌性颗粒，蛋白激酶C结合，BH域结合等，其中细胞氧化应激反应，BH域结合与PMOP发生发展过程中成骨细胞凋亡密切相关。雌激素缺乏等凋亡信号可激活内源性线粒体途径，促凋亡蛋白BH3-only上调，从而抑制抗凋亡的Bcl-2家族成员。如果所有可用的抗凋亡蛋白都被BH3-only蛋白隔离，促凋亡蛋白Bax和BCL-2 Antagonist/Killer 1(Bak1)被活化后聚集在线粒体外膜形成同源寡聚体或自发寡聚化，促进1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)开放或直接在线粒体外膜穿孔，破坏线粒体外膜，释放细胞色素C到细胞质[15]，激活胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3等，切割DNA修复酶多腺苷二磷酸核糖聚合酶[16]，导致成骨细胞凋亡的发生。说明XLGB可以对该过程进行调控，KEGG通路富集结果中细胞凋亡信号通路富集了7个基因且显著性最强，亦佐证了这一结论。利用Cytoscape软件将共同靶点和显著富集的KEGG通路进行网络可视化分析，发现AKT1、NFKB1、BAX等靶点处于中心位置，这些可能是仙灵骨葆胶囊治疗PMOP的关键作用靶点。

实验验证部分建立去卵巢大鼠模型，通过检测骨密度、血清活性氧水平、骨组织凋亡率及凋亡相关键蛋白，验证XLGB影响细胞凋亡治疗PMOP。首先骨密度结果与既往研究结果一致[11，17]，XLGB可有效改善去卵巢大鼠腰椎骨密度。PMOP的发生与雌激素水平骤然下降活性氧产生增多密切相关[18-19]，XLGB干预后血清活性氧明显下降。病理染色结果同样提示，XLGB干预后，股骨远端骨组织细胞凋亡率明显降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量升高，而促凋亡蛋白Bax表达量显著下降，提示XLGB可能通过清除活性氧影响细胞凋亡发挥抗PMOP作用。

综上所述，本研究采用生物信息学和网络药理学的方法，分析了XLGB治疗PMOP的作用机制，并进行动物实验，验证XLGB通过影响细胞凋亡发挥治疗作用，为深入研究药物作用的分子机制和药效物质基础奠定基础。本研究的局限性在于XLGB具有多通路、多靶点的作用特点，本研究仅进行了凋亡信号通路的验证，未明确其对上游信号通路的作用，因此后续将针对这方面展开探索。