基于P糖蛋白研究仙茅对顺铂耐药非小细胞肺癌细胞的增敏机制

郝 雨 朱宝琛 薛春苗, 华国栋 高若瑜 黄 鑫 刘文卉 王 萌

(1 北京中医药大学中药学院，北京，102488； 2 北京中医药大学东直门医院，北京，100700)

近年来，全球肺癌死亡人数居癌症之首[1]，顺铂(Cisplatin)为肺癌化疗的一线用药[2]，然而，化疗仅初始治疗效果明显，长期治疗效果并不理想，且在接受化疗后高达90%的肺癌患者最终复发[3-4]。非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC)的继发性化疗耐药严重影响了肺癌的临床治疗效果。同时，耐药细胞富集了癌症干细胞样的特性，更易于复发和转移[5-7]。P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，又称为多药耐药蛋白1(Multidrug Resistance Protein 1，MRP1)，是最早被发现的ATP结合盒(ATP-binding Cassette，ABC)转运蛋白，在人体由ATP结合盒B亚家族成员1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1,ABCB1)基因编码，是ATP依赖性的多药外排泵，主要起跨膜转运作用[8]。P-gp普遍表达于NSCLC病理组织中[9]。因而，抑制肿瘤组织P-gp表达的药物联用策略有望提高NSCLC对顺铂的敏感性，提高肿瘤抑制率。

现代药理学研究表明，中药仙茅具有一定的抗肿瘤活性，如卢逸儒等[10]研究发现仙茅水煎液在体外对鼠源S180、MFC细胞，人源SGC-7901、SMMC-7721细胞均具有较好的抑制作用；在小鼠体内实验中，对S180、MFC移植瘤均有显著抑制作用。彭梅等[11]研究发现热水浸提的仙茅多糖对S180移植瘤小鼠有较好的抗肿瘤作用。同时仙茅能够调节免疫功能，可改善化疗导致的免疫功能降低，是中药抗肿瘤的潜在药物之一[12-15]。课题组前期研究发现苔黑酚葡萄糖苷(Orcinol Glucoside，OG)是仙茅水提取物中含量较高的主要成分之一，且是仙茅主要入血成分之一[16]。目前，国内外尚无仙茅影响肿瘤耐药的相关研究，本文以NSCLC顺铂耐药细胞A549/cis为研究对象，观察仙茅水煎液及OG对肿瘤细胞耐药性和P-gp表达的影响，为仙茅在抗肺癌耐药中的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 A549/cis细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心(资源编号：1101HUM-PUMC000519)

1.1.2 药物 仙茅(北京盛世龙药业有限公司，批号：1911151)，苔黑酚葡萄糖苷(成都植标化纯生物技术有限公司，批号：220123)，顺铂注射液(江苏豪森药业集团有限公司，国药准字H20040813)。

1.1.3 试剂与仪器 1×磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Solution，PBS)(0.01 mol/L，pH 7.22～7.4，批号：20211222)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)消化液(胰蛋白酶0.25%，EDTA 0.53 mmol/L，批号：20220217)、RPMI 1640培养基(批号：20210909)、二甲基亚砜(细胞培养级，批号：1209M0312)、二辛可宁酸(Bicinchoninic Acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒(批号：20210922)、高效RIPA组织/细胞裂解液(批号：R0010)、5×蛋白质上样缓冲液[含二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)](批号：20220106)、彩虹245广谱蛋白Marker(11～245 kDa，批号：PR1920)、一抗稀释液(批号：A1810)均购自北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：21110701)，PAGE凝胶快速制备试剂盒(7.5%，批号：PG111)、脱脂奶粉(批号：PS112L)均购自上海雅酶生物科技有限公司，ECL化学发光底物试剂盒(超特敏)(北京兰杰柯科技有限公司，批号：21299536)，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Difluoride，PVDF)膜(0.45 μm，Merck Millipore Ltd.，德国，批号：R1CB66016)，Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(批号：AB0101)、Beta Actin Antibody(批号：AB0035)均购自上海泊湾生物科技有限公司，CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒[东仁化学科技(上海)有限公司，批号：CK04]，Anti-P Glycoprotein抗体[艾博抗(上海)贸易有限公司，批号：ab235954]；CO2细胞恒温孵育箱(SANYO公司，日本，型号：MCO-20AIC)，倒置相差显微镜(Leica公司，德国，型号：DMi1)，恒温预热水箱(天津泰斯特仪器有限公司，型号：HHW21.420AII)，全自动酶标仪(Thermo公司，美国，型号：VLBLATD0)，超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司，型号：DL-CJ-2NDⅠ)，全自动化学发光图像分析系统(Tanon公司，型号：5200)，加热型恒温金属浴(OHAUS公司，型号：HB2DGHL)，电泳电源(基础型)(北京龙方科技有限公司，型号：LF—600)，电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号：AL20]，托盘天平(宁波浪力仪器有限公司，型号：11004)，台式离心机(中国雷勃尔公司，型号：LD5-2)，低温高速离心机(Heraeus公司，德国，型号：Sepatech biofuge 28RS)，高压蒸汽灭菌器(SANYO公司，日本，型号：MLS-3780)，超低温冰箱(-80 ℃)(Thermo公司，美国，型号：900 SERIES)，纯水机(Millipore公司，美国，型号：Mili-QA10+)，制冰机(SANYO公司，日本，型号：SIM-F124)。

1.2 方法

1.2.1 分子对接 使用带有NVIDIA Geforce GTX1050Ti图形卡和Core i5处理器的台式计算机进行分子对接分析。在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载OG的三维结构SDF文件(Compound CID：12315192)，经AutoDockTools(v1.5.6)加极性氢、分配电荷、设置可旋转键后保存为“pdbqt”格式文件；利用PDB(https://www.rcsb.org/pdb/)蛋白数据库下载P-gp的蛋白三维晶体结构PDB文件(PDB ID：5KPI)，使用AutoDockTools对结构进行添加极性氢、固定原子类型、固定键序、添加电荷、设置质子化状态和删除额外的水等处理并保存为“pdbqt”格式文件。使用目标活性位点中的共结晶配体生成结合口袋。用虚拟筛选软件AutoDock Vina(v1.1.2)和Discovery Studio(v16.1.0)预测配体和靶点之间的相互作用。结果用预估的结合自由能表示。选择结合能小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)的对接结果进行结合构型和相互作用模式的研究，使用Discovery Studio对结果进行可视化。

1.2.2 仙茅水煎液的制备 称取仙茅饮片64.04 g，加10倍量水浸泡1 h，煎煮0.5 h，趁热过滤，再加入10倍量水煎煮0.5 h，趁热过滤，合并两次煎液，浓缩至1 L，即得。

1.2.3 细胞培养 A549/cis细胞在含15%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱培养，传代周期为4 d(1∶3传代)，待细胞处于对数生长期时用于实验。

1.2.4 细胞分组与给药方法 A549/cis细胞依据实验需要接种于96孔板或培养皿中，CCK-8分组：空白组、溶剂对照组、给药组。给药浓度：在药物单用实验中，顺铂梯度浓度分别为0、0.75、1.5、3、4、5、7、9、11、15 μg/mL，仙茅水煎液梯度浓度分别为10、50、100、500、750、1 000、1 250、1 500 μg/mL，OG梯度浓度分别为3×10-6、7×10-6、1×10-5、3×10-5、5×10-5、7×10-5、1×10-4、3×10-4mol/L[17-18]；放讨论中在药物联用实验中，顺铂高、中、低3个剂量(7 μg/mL、4 μg/mL、1.5 μg/mL)与仙茅水煎液高、低剂量(1 000 μg/mL、500 μg/mL)及OG高、低剂量(5×10-5mol/L、1×10-5mol/L)联合给药。蛋白质免疫印迹细胞分组：空白组、顺铂单用组、顺铂与仙茅水煎液联用组、顺铂与OG联用组；给药浓度：顺铂1.5 μg/mL、仙茅水煎液1 000 μg/mL、OG 5×10-5mol/L。CCK-8与蛋白质免疫印迹法中药物对细胞的作用时间均为48 h。

1.2.5 CCK-8法测定细胞活力抑制率 待细胞处于对数生长期，用0.25%的胰蛋白酶消化液(含EDTA)消化，离心半径8 cm，1 000 r/min离心5 min，吸去胰酶后将细胞重悬，计数，调整细胞浓度，以10 000个细胞/孔种于96孔板，待细胞贴壁后进行分组给药。实验终点，吸去孔内液体，以PBS 100 μL/孔清洗1次，再加入100 μL CCK-8的完全培养基稀释液(1∶10稀释)，置培养箱孵育1～1.5 h后用酶标仪在450 nm下检测吸光度，计算各孔的细胞活力抑制率，计算公式为：抑制率(%)=[(A空白组-A观察组)/(A空白组-A溶剂对照组)]×100%。

1.2.6 蛋白质免疫印迹法检测P-gp的表达水平 取分组给药完成的细胞，弃去培养基，用PBS清洗2遍，加入适量含蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(1∶1∶100)，在冰上裂解0.5 h、用细胞刮刀刮下细胞，收集于4 ℃预冷的1.5 mL离心管中，离心半径10 cm，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入双蒸水使得各组成等浓度的蛋白溶液，加入5×蛋白质上样缓冲液，100 ℃金属浴加热10 min后，分装并于-80 ℃保存。蛋白质免疫印迹法：每孔蛋白上样量10 μg，用7.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转印于0.45 μm PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST漂洗后一抗孵育过夜，TBST洗膜(10 min×3次)，二抗孵育2 h，洗膜，ECL显色、曝光，用Image J软件分析条带灰度值。

2 结果

2.1 P-gp与OG的模拟分子对接 P-gp与OG的结合自由能为-7.6 kcal/mol，表明二者可自发结合且有良好的结合活性。二者的分子对接图和相互作用模式见图1，结果显示，P-gp可以同OG形成范德华力以及疏水作用从而发生稳定结合。OG主要在P-gp的A：GLU489、A：LYS911、A：GLN910、A：THR914、A：ASP490、B：ARG908残基上形成氢键，与A：LYS911残基上形成π-烷基相互作用力，使结合更加牢固[19]。由此，OG可能在机体中与P-gp结合而对其生物过程产生影响。

图1 P-gp与OG的分子对接图和相互作用模式

2.2 顺铂、仙茅水煎液、OG对A549/cis细胞活力的抑制率 顺铂对A549/cis的抑制率随给药浓度升高而增大，用Excel分析其曲线的线性趋势方程，计算得到顺铂对A549/cis细胞的半抑制浓度(Half-maximal Inhibitory Concentration，IC50)约为5.5 μg/mL；各给药浓度仙茅水煎液和OG对A549/cis细胞活力均没有显著影响。见表1。

表1 顺铂、仙茅水煎液、OG对A549/cis细胞活力的抑制率

2.3 顺铂与仙茅水煎液、OG联用对A549/cis细胞活力的抑制率 与顺铂低剂量(1.5 μg/mL)单用组比较，联用组抑制率均升高，其中顺铂与仙茅水煎液高、低剂量、OG高剂量联用组升高显著(P<0.05或P<0.01)；与顺铂中剂量(4 μg/mL)单用组相比，各联用组抑制率均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与顺铂高剂量(7 μg/mL)单用组相比，其与仙茅水煎液高、低剂量、OG低剂量联用组抑制率均升高，其中顺铂与OG低剂量联用组升高显著(P<0.01)，而顺铂与OG高剂量联用组的抑制率则略微降低。见表2，图2。

表2 顺铂与仙茅水煎液、苔黑酚葡萄糖苷联用对A549/cis细胞活力的抑制率

图2 顺铂与仙茅水煎液、苔黑酚葡萄糖苷联用对A549/cis细胞活力的抑制率

2.4 顺铂与仙茅水煎液、OG联用对A549/cis细胞P-gp表达水平的影响 顺铂(1.5 μg/mL)与仙茅水煎液(1 000 μg/mL)及OG(5×10-5mol/L)联用组P-gp水平均低于空白组和顺铂单用组。其中与顺铂单用组比较，顺铂与仙茅水煎液联用组P-gp表达水平降低显著(P<0.05)。结果见表3，图3。

图3 顺铂与仙茅水煎液、OG联用对A549/cis细胞P-gp表达水平的影响

表3 顺铂与仙茅水煎液、OG联用对A549/cis细胞P-gp表达水平的影响

3 讨论

2020年全球肺癌死亡人数约180万(男119万，女61万)，有研究预估，由于人口老龄化、预期寿命延长等，2035年这一数字将增至约300万(男210万，女90万)[20]，肺癌发病率的升高给社会和人民造成了沉重经济负担。由于肺部的感觉神经不发达，早中期的肺癌患者常无明显症状，只有当肿瘤进展侵袭胸膜、支气管、神经等部位时才会有胸痛、咳血等症状，故仅有约20%患者可于早期发现，大多数肺癌患者发现时都已是晚期，基本失去了手术的机会。在这种情况下，只能通过放化疗来控制癌症进展。但在临床应用中发现，众多患者首次化疗敏感性高，随后敏感性迅速降低，表明肺癌易产生继发性耐药，严重影响临床结局。

气阴两虚、痰瘀毒聚是肺癌发病过程中的主要病机特征，而肺癌晚期患者往往由于气阴两伤日久，以致阴损及阳，阴阳两虚。且晚期患者多仅能使用放化疗方法进行干预，化疗最主要的不良反应即为白细胞减少症，中医认为，脾肾阳虚是肺癌化疗后白细胞减少症发生的根源所在，故化疗可导致晚期肺癌患者阳虚更甚。中药仙茅为石蒜科植物仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)的根茎，药性辛，热，有毒，归肾、肝经，具有补阳气、强筋骨、祛寒湿的功效，对于经化疗的晚期肺癌患者可以补阳扶正，促进阴阳平衡，增强免疫功能[15]，且研究证实仙茅亦有一定抗肿瘤作用[10-11]。本研究结果显示，仙茅及OG单用并无显著杀伤A549/cis细胞的作用，但联用顺铂后可使顺铂对A549/cis的杀伤作用增强，提示仙茅及OG可从其他途径增强顺铂的抗肿瘤作用。

NSCLC产生多药耐药性的作用机制尚不完全清楚，目前研究认为P-gp在其中起关键作用[21-23]，P-gp属于ABC超家族，是ATP依赖性的多药外排泵，主要起跨膜渗透泵作用，多项研究已证实P-gp与药效减弱相关联，未来ABC转运体可能成为某些类型癌症的生物标志物和治疗靶点，在多药耐药中发挥临床作用[8]。本实验以中药仙茅与顺铂联用对肺癌耐药细胞的作用为切入点，首先用模拟分子对接预测P-gp与仙茅有效成分OG具有良好的结合活性，再通过实验发现仙茅水煎液和OG与顺铂联用可以增大对A549/cis细胞的抑制率，并且二者可抑制A549/cis细胞P-gp的表达。以上研究结果表明仙茅对肺癌顺铂耐药细胞有一定增敏作用，其机制可能与抑制耐药细胞的P-gp表达相关，通过抑制P-gp表达，减少其对顺铂的外排，进而增强顺铂的抗肿瘤作用。然而，由于本研究仅在体外实验中探讨了仙茅及其入血成分对肺癌顺铂耐药细胞的增敏作用，没有进行体内研究，后续还需要开展动物实验及临床试验对该方面进行深入探讨，以进一步明确仙茅抗肺癌耐药的作用机制，为发挥仙茅在抗肺癌耐药中的临床应用价值提供实验支持。