HPLC法测定鸿茅药酒中胡椒碱含量
2022-02-03刘晓华刘利芳王建国陈昕宇
刘晓华,张 飞,刘利芳,王建国,陈昕宇,郭 静,张 静
(内蒙古鸿茅药业有限责任公司,内蒙古 乌兰察布 013750)
鸿茅药酒由荜茇、小茴香、肉桂、高良姜、红曲等六十七味药材组成的复方制剂。标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十四册(标准编号:WS3-B-2792-97),目前没有含量测定项。因此,本文根据荜茇药材在鸿茅药酒中占有较多(0.50 mg/100mL)的特点,选择荜茇中胡椒碱为指标成分,进行HPLC含量测定方法的验证。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪(岛津LC-20AT、岛津LC-10AT);百万分之一电子天平(XPR10型);万分之一电子天平(ESJ182-4型)。
1.2 试剂与试药
鸿茅药酒各批号供试品由内蒙古鸿茅药业有限责任公司提供;胡椒碱对照品(批号:110775-202107,含量:98.2%),由中国食品药品检定研究院提供;甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
2 方法学考察
2.1 色谱条件
采用Shim-pack GIST C18, 250mm×4.6mm I.D,5μm色谱柱和BETASIL C184.6mm*250mm,5μm色谱柱;以甲醇-水(77∶23)为流动相,胡椒碱的分离度大于1.5;40℃柱温;检测波长343nm;理论板数以胡椒碱峰计1500以上。
2.2 实验用溶液的制备
精密量取鸿茅药酒100mL,用石油醚(60~90℃)振摇提取三次,每次50mL,合并石油醚液,挥干,残渣加甲醇溶解,定容至10mL容量瓶中,微孔滤膜滤过,续滤液作为供试品溶液。取胡椒碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含20μg的溶液,作为对照品溶液。再取按处方比例并以相同工艺制备的缺荜茇的阴性对照样品,按供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。
2.3 专属性考察
在上述色谱条件下,分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10μL,分别注入液相色谱仪。
测得结果为:阴性对照色谱图中在与胡椒碱对照品以及供试品色谱图相应的保留时间处无色谱峰出现,表明其他组分对胡椒碱的测定无干扰。见阴性对照图谱、胡椒碱对照品图谱、供试品图谱、数据比较图谱。
图1 阴性对照图谱、胡椒碱对照品图谱、供试品图谱、数据比较图谱
2.4 线性关系
取胡椒碱对照品约2.0mg,精密称定,置100mL量瓶中,加甲醇使溶解,并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液(对照品溶液实际浓度为20.9μg/mL);分别吸取对照品溶液6.0μL、8.0μL、10.0μL、12.0μL、14.0μL注入液相色谱仪,记录色谱图。胡椒碱在0.1254μg~0.2926μg范围内呈良好的线性关系,回归方程为y=156311x-7011.79,r=0.9999。标准曲线数值见表1。标准曲线见图2。
表1 胡椒碱标准曲线数值表
图2 胡椒碱标准曲线图
2.5 精密度
取同一份供试品(批号:20220601),连续进样测定。6针精密度RSD(%)=0.06%,见表2。
表2 同一供试品连续进样6针精密度结果
2.6 溶液稳定性
取同一份供试品(批号:20220601),15h稳定性RSD(%)=1.23%,见表3。
表3 同一供试品15小时稳定性结果
2.7 耐用性试验
取同一份供试品(批号:20220601),不同型号的色谱仪、不同的色谱柱测定,结果基本一致,见表4。
表4 同一供试品不同色谱柱型号及色谱仪型号稳定性结果
2.8 重复性
取同一样品的6份供试品,测定,其RSD(%)=0.60%,见表5。
表5 同一批号6份供试样品重复性结果
2.6 加样回收试验
精密量取含有胡椒碱为0.4478mg/100mL的鸿茅药酒6份,各100mL,加入0.506mg/mL胡椒碱对照品溶液1mL,按供试品制备方法制备并测定。加样回收率结果见表6。本方法的平均回收率为101.98%,符合《中国药典》2020年版四部9101“药品质量标准分析方法验证指导原则”中“表2 样品中待测定成分含量和回收率限度”的要求。
表6 胡椒碱加样回收试验结果
3 样品含量测定
取样品约100mL,各两份,精密量取,制备并测定,结果见表7。
表7 样品中胡椒碱的含量测定结果
4 讨论
4.1 提取方法的选择
由于鸿茅药酒是由67味药材和大量的糖、白酒构成,每味药材的量很少,再加上大量的糖的干扰,供试品前处理比较难。经过对前处理方法比较,其中,氯仿萃取法、乙醇提取法处理样品,方法基本可行,但是,氯仿毒性大,乙醇提取杂峰多,因此,均没有采用。
本文采用直接用石油醚(60~90℃)萃取被测组分同时可以排除大量糖的干扰,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液的制备方法。优点是操作简单,能够除去大量糖的影响,对待测组分有富集作用,该方法的回收率较高,制备的供试品溶液黏度很小,没有造成对色谱柱的堵塞等现象。故采用此制备方法作为前处理样品的方法。
4.2 柱温的选择
采用40℃可以保证柱压较低,消除残留在样品溶液的糖分影响,分离效果稳定,保留时间变化小。温度的变化,对胡椒碱出峰时间有影响,但对峰面积的影响较小。
5 结果
HPLC对鸿茅药酒中荜茇药材的指标性成分进行测定,经分析方法验证,表明该方法重现性好,专属性强,方中其它组分对胡椒碱的测定无干扰。