我国不同产地党参药材中糖类成分比较分析

黄延盛，张欣，刘耀军，胡流云，王长虹，王峥涛，黄晓君

(1.无限极(中国)有限公司，广东 广州 510623；2.上海中药标准化研究中心，上海 2012033.南昌大学a.食品科学与技术国家重点实验室;b.中国-加拿大食品科学与技术联合实验室c.江西省生物活性多糖实验室，江西 南昌 330047)

党参属(Codonopsis)隶属桔梗科(Campanulaceae)，全属共40余种，我国有39种，野生党参主要分布于西南各省区，栽培党参则主产于西北、华北地区[1]。本属植物党参(Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.)、素花党参(C.pilosulavar.modesta(Nannf.)L.T.Shen.)及川党参(C.tangshenOliv.)为2010版《中国药典》收载品种[2]，其干燥根作为党参入药，具有补中益气，健脾益肺之功效[3]。用于脾肺虚弱、气短心悸、食少便溏、虚喘咳嗽、内热消渴等症[4-8]。党参属大多数种类的根部都具有药用价值，一些种类如管花党参(C.tubulosaKom.)、球花党参(C.subglobosaSrnith.)、灰毛党参(C.canescensNannf.)、新疆党参(C.clematidea(Schrenk)Clarke.)等在临床上也作为党参使用[9]。

党参中含有单糖、低聚糖和多糖等糖类物质，单糖有果糖，低聚糖有菊糖等[10-12]。党参多糖同其他药用植物多糖一样，具有广泛的药理作用，主要包括调节机体免疫、清除自由基和造血等作用，其中尤以党参多糖的免疫调节作用研究得较多和较深入，主要表现为增强免疫作用，与党参补中益气、健脾益肺之功效相符[13-14]。从化学组成可见，素花党参多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6种单糖组成，HPLC法测得其物质的量比为0.07:0.22:1.00:4.38:0.81:1.40，主要含有葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸[15]。GC法分析表明，党参粗多糖的单糖组成为阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、木糖，物质的量比依次为1.0:10.5:2.0:1.4:1.0[16]。另一研究结果表明，党参中性杂多糖COP-Ⅰ的单糖组成为甘露醇、果糖、葡萄糖，物质的量比为1:0.05:1.56；党参酸性杂多糖COP-Ⅱ的单糖组成为甘露醇、果糖、葡萄糖和半乳糖，物质的量比为1:0.11:1.07:0.37。由此可以看出，不同品种的党参多糖的组成和物质的量比均存在一定的差异[17]。这些研究为党参多糖的结构分析奠定了基础。党参多糖含量高低可以初步反映党参药材质量的好坏，是鉴别党参药材的方法之一。

目前，对于党参中多糖含量测定方法已有很多，多采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量，该方法具有操作简单、快速、重复性好、显色后稳定性较好等优点，但对有色样品结果易偏高[18]。多糖可用与其组成结构相近的多糖作标准曲线，但更多的情况下是以相应的单糖作标准。本研究通过测定党参的多糖含量、单糖组成，以及建立党参中5种糖类成分的HPLC-ELSD定量分析方法，并通过测定35批党参中5种糖类成分含量，为党参质量标准中糖类成分含量测定项的完善提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

党参药材，35批党参主要来源于甘肃、贵州、山西、湖北、四川等党参主产区，包括2015版《中国药典》收录的3种党参药材：党参、素花党参、川党参。由上海中药标准化研究中心吴立宏研究员鉴定，其性状与2015年版《中国药典》所规定的党参药材一致，鉴定为正品。

无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸、三氟乙酸、冰醋酸、乙酸酐、盐酸、硼氢化钠、甲醇、甲苯、氯仿(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；三乙胺、乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，美国Fisher公司);D-(+)-葡萄糖、D-果糖、蔗糖(分析纯，上海源叶生物科技有限公司)；蔗果三糖、蔗果四糖(分析纯，上海西宝生物药业有限公司)。

1.2 仪器与设备

KQ-250DB数控超声波清洗仪(江苏昆山市超声仪器有限公司)；高速离心机(美国BECKMAN公司)；旋转蒸发仪N-1001、OSB-2000水浴锅(日本EYELA公司)；BP211D电子分析天平(德国Sartourius公司)；MILLI-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司)；Agilent1100高效液相色谱仪；Agilent GC-MSD7890B气质联用色谱仪(美国Agilent公司)。

色谱柱：X-Bridge Amide C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)(美国Waters公司)

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

每个产地党参样品中挑选200 g无霉变、外观良好的党参用粉碎机粉碎，过药典标准3号筛(筛孔孔径为0.355 mm)备用。

1.3.2 党参多糖含量测定

1.3.2.1 标准液的配制

精密称取经105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖900 mg置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液1.0 mL置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀,即得90.0 μg·mL-1的葡萄糖溶液。

1.3.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，0.9，1.0 mL，分别置于10.0 mL具塞试管中，各加水补至1.0 mL，精密加入质量分数为5%的苯酚溶液1.0 mL(临用配制)，摇匀，再精密加浓硫酸5.0 mL，摇匀，至沸水浴中加热30 min后取出，迅速置于冰水浴中冷却5 min，空白对照以1.0 mL蒸馏水代替葡萄糖对照品溶液，照紫外-可见分光光度法，在482 nm下测定吸光度，以吸光度(x)为纵坐标，质量浓度(y)为横坐标，进行线性回归，得回归方程：y=0.009x-0.008 6,R2=0.998 6。结果表明，葡萄糖质量浓度在18.01～90.05 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

ρ/(μg·mL-1)图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

1.3.2.3 样品前处理

取党参粉末1.0 g，精密称定，加水200 mL，加热回流2.0 h，放冷，转移至250 mL容量瓶，用少量水分次洗涤容器，洗涤液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤。精密量取续滤液3.0 mL至离心管中，加入无水乙醇15.0 mL，摇匀，冷藏1.0 h，取出，离心15 min(转速为4 000 r·min-1)，弃去上清液，沉淀加体积分数为80%的乙醇洗涤2次，每次8.0 mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25 mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。

1.3.2.4 多糖含量的测定

精密量取样品溶液1.0 mL，按照“葡萄糖标准曲线的绘制”的方法测定其吸光度，计算出不同批次党参多糖含量。

1.3.3 党参多糖的单糖组成分析

1.3.3.1 党参多糖的提取与精制

分别取10.0 g党参(S7、S21、S31)药材粗粉，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入250 mL石油醚脱脂，回流提取2.0 h过滤，药渣挥尽石油醚后，以80%乙醇500 mL浸渍过夜，85 ℃回流提取2次，每次1.5 h，过滤，药渣加蒸馏水浸渍1.0 h后，100 ℃回流提取60 min，过滤，再用500 mL蒸馏水100 ℃提取30 min，过滤，合并滤液，减压浓缩至150 mL，与等体积Sevage试剂(V(三氯甲烷)：V(正丁醇)=4:1)混合，振摇，以除去蛋白质。加体积分数为95%的乙醇使含醇量达80%(V/V)冰箱静置过夜。过滤，残渣先后用95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮依次多次洗涤，冻干，即得精制党参多糖0.72 g。得率为7.2%。其中S7为纯白色疏松粉末，S21为白色粉末，S31为灰白色粉末。

1.3.3.2 多糖水解及单糖衍生化产物的制备

称取3.0 mg精制党参多糖，转入10 mL安瓿瓶中，各加入3.0 mL 2 mol·L-1三氟乙酸溶解，拉丝封口，120 ℃油浴中水解反应2.0 h，取出转移到心形瓶，减压蒸干，加甲醇蒸干3次，以完全除尽三氟乙酸；残余物加入50.0 mg NaBH4和2.0 mL水，混匀后室温还原反应过夜(还原8.0 h以上即可)；加适量冰醋酸以除去过量的NaBH4，减压浓缩至黏稠液体；加入冰醋酸-甲醇(体积比1:5)3.0～5.0 mL，蒸干3次，再加乙腈蒸干2次，得到白色粉末，放入烘箱105 ℃加热5 min以除去水分，快速加入3.0 mL乙酸酐，置101 ℃烘箱中乙酰化反应1.0 h，取出，加适量水溶解静置10 min，加2.0～3.0 mL氯仿用水萃取3次，吸出上层水层，取出氯仿层，用无水硫酸钠干燥浓缩至0.5 mL进行GC-MS分析(适量棉花堵住1.0 mL枪头，用无水硫酸钠填充，让样品溶液滤过枪头流入气相小瓶)。标准品与样品同时处理，进样。

1.3.3.3 气相条件

GC-MS程序升温条件：起始温度120 ℃，以2 ℃·min-1升温至180 ℃，保温4 min，再以1 ℃·min-1升温至200 ℃，最后以3 ℃·min-1升温至250 ℃，保持5 min；进样口温度为250 ℃；氦气载气，流速为1 mL·min-1。单糖标准品与样品进行图谱对照。提取特征峰为115m/z。

1.3.4 党参中单糖及低聚果糖含量测定

1.3.4.1 对照品溶液的制备

分别称取D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖对照品适量，精密称定，加入60%甲醇(V/V)制成每毫升含D-果糖0.607 4 mg、D-葡萄糖0.504 8 mg、蔗糖0.590 3 mg、蔗果三糖0.561 1 mg、蔗果四糖0.685 7 mg的溶液，即得。

1.3.4.2 样品前处理

取本品细粉约0.05 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇10.0 mL，称定质量，超声处理(功率250 W,频率40 kHz)60 min，放冷，再称定质量，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取滤液2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤取滤液，即得。

1.3.4.3 色谱条件

Waters X-Bridge Amide C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)；以乙腈(A)-甲醇(B)-0.05%三乙胺水(C)为溶剂按表2进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温40 ℃，蒸发光散射检测器采用撞机器关(impactor off)的模式，漂移管温度控制在100 ℃，气体流速1.5 mL·min-1。

2 结果与分析

2.1 党参多糖含量测定

2.1.1 最优反应温度和反应时间的筛选

2.1.1.1 反应温度的考察

取供试品溶液共4份，每份3个平行样，经苯酚-浓硫酸显色后，分别在40，60，80，100 ℃保温0.5 h，考察吸光度值变化。结果表明接近沸水浴的温度，吸光度越接近，即此阶段反应温度为最佳反应温度。最终反应温度确定为100 ℃。

2.1.1.2 反应时间的考察

取供试品溶液5份，每份3个平行样，经苯酚-浓硫酸显色后，分别在不同反应时间10，20，30，45，60 min保温后，考察吸光度变化。结果表明10～60 min之间吸光度无明显变化，即反应时间对吸光度无明显影响。故最终反应时间取中间时间点为30 min。

表2 反应时间考察表(n=3)Tab.2 Reaction time(n=3)

2.1.2 方法学考察结果

2.1.2.1 精密度试验结果

精确量取样品1.0 mL，按照“葡萄糖标准曲线的绘制”的方法测定其吸光度，进行5次平行测定。结果的RSD为0.006 9%，表明仪器精密度良好。

表3 精密度试验Tab.3 Precision experiment

2.1.2.2 重复性试验结果

精确量取1.0 mL党参样品，平行5份，按照“葡萄糖标准曲线的绘制”的方法测定其吸光度，结果RSD为4.35%，表明方法重复性良好。

表4 重复性试验Tab.4 Repeatability experiment

2.1.2.3 稳定性试验结果

精确量取样品1.0 mL,然后按照“葡萄糖标准曲线的绘制”的方法测定其吸光度，分别在0，10，20，30，45，60，90，120 min时测定吸光度值。结果表明供试样品溶液在2.0 h内是稳定的。

表5 稳定性试验结果Tab.5 Stability experiment

2.1.2.4 加样回收率试验结果

精密量取0.5 mL 15号党参样品液6份，分别加入质量浓度为0.066 41 mg·mL-1的葡萄糖标准液0.5 mL，按照“葡萄糖标准曲线的绘制”的方法测定其吸光度，结果见表6。

2.1.2.5 多糖含量测定结果

精密量取样品溶液1.0 mL，按照“葡萄糖标准曲线的绘制”的方法测定其吸光度，计算出不同批次党参多糖含量，结果见表7。

表6 加样回收率试验结果(n=6)Tab.6 Recovery experiment(n=6)

表7 党参药材多糖含量测定结果(n=2)Tab.7 Polysaccharide content of Codonopsis pilosula (n=2)

结果表明，35批党参中，多糖含量在5.3%～28.1%的范围，平均含量为16.9%±6.0%。按照下浮20%计算，可暂定含多糖不得低于13.5%。

2.2 党参单糖组成分析结果

将3批不同品种党参，分别是产于甘肃省渭源县的素花党参S7(西党)、湖北省恩施市的川党参S23(板党)以及产于山西省陵川县的党参S31(潞党)，按气相条件进样，3种党参糖组成图谱见图2。

t/minA.潞党；B.板党；C.西党；D.单糖混合标准品。1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.木糖；4.甘露糖；5.葡萄糖；6.半乳糖。

可知，3种基源党参的多糖组成大致相同，均含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。并且3种党参的物质的量比分别为：素花党参S7=0.8:1.2:0.4:19.2:6.8；川党参S23=1.4:3.2:0.8:21.2:6.8；党参S31=1.6:1.9:1.4:20.2:6.8。

2.3 党参中单糖及低聚果糖含量测定结果分析

2.3.1 对照品与样品色谱图

党参中主要单糖及低聚果糖为D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖。HPLC-ELSD色谱图如图3。

图3 混合对照品和样品的HPLC-ELSD色谱图Fig.3 HPLC-ELSD chromatograms of mixed reference and sample

2.3.2 方法学考察

2.3.2.1 线性关系及定量限、检测限的考察

精密吸取“对照品溶液的制备”项下5种糖类对照品溶液适量，制成混合标准品贮备液，并逐级稀释成一系列标准品混合溶液，进样10.0 μL，得到各标准对照品的标准曲线及线性范围，并分别按信噪比(S:N)为3:1和10:1计算各标准品的检测限和定量限，结果如表8。

表8 党参中5种糖类成分的线性方程、线性范围以及其定量限和检测限Tab.8 Linear equation,range and the limit of quantitation and detection between five kinds of carbohydrate components of Codonopsis pilosula

2.3.2.2 精密度考察

取高、中、低3种不同质量浓度混合对照品溶液各10.0 μL，连续进样6次，分别计算D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的日内、日间精密度。5种物质峰面积的日内、日间精密度RSD均在5%以内，表明仪器及进样精密度良好，结果见表9。

表9 D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的日内、日间精密度Tab.9 Intra-day and inter-day precision of D-fructose,D-glucose,Sucrose,Kestose,Nystose

2.3.2.3 重复性实验结果

取7号样品细粉0.05 g，精密称定，按供试品溶液制备方法操作，平行制备6份供试品溶液，测得D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的平均含量分别为6.8%、1.0%，4.0%，1.2%和0.6%，RSD分别为1.82%，1.91%，1.94%，0.93%，1.38%，表明重复性良好。

2.3.2.4 稳定性实验结果

精密吸取同一供试品溶液(S7)，分别于0，1，3，5，9，12，18，24，36 h进样，测定D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的峰面积，其峰面积的RSD分别为3.49%，2.81%，2.76%，2.43%，2.15%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.3.2.5 加样回收率实验结果

取党参药材(S7)9份，分别按已知质量含量的80%，100%，120%加入D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖对照品溶液，每一比例平行做3份；按供试品溶液制备方法操作，计算各成分的加样回收率，5种物质的加样回收率见表10。

2.3.3 样品检测结果

35批党参和饮片中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量测定，见表11和图4。

表10 D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的加样回收率(n=9)Tab.10 Recovery experiment of D-fructose，D-glucose，sucrose，kestose，nystose

表11 党参原药材中35批党参和饮片中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量(n=2,以干燥品计算含量)Tab.11 The content of D-fructose，D-glucose，sucrose，kestose，nystose in sample of Codonopsis pilosula

图4 党参中5种糖类物质含量比较Fig.4 Comparison of the contents of five sugars in Codonopsis pilosula

从图4看出党参中35批党参和饮片中D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量存在种内和种间差异。其中D-果糖、蔗糖和葡萄糖为党参药材中主要糖类成分，不同品种之间差异较大，质量含量范围分别为10.69～157.54，5.36～23.06和8.00～50.38 mg·g-1。其中D-果糖含量在S1～S10(素花党参)中相对较低，在S12～S19(素花党参)样品中含量相对较高。D-果糖在S20～S28(川党参)中含量与素花党参相当，并且随着生长年限的增加逐渐增加。D-葡萄糖在素花党参中的含量分布和D-果糖类似。蔗糖含量在3种党参中差异较大，总体而言素花党参>党参>川党参。

3 结论

本文通过使用HPLC-ELSD方法对我国5个主要党参产区(甘肃、贵州、山西、湖北、四川)的党参、素花党参和川党参中的多糖含量、单糖组成、D-果糖等5种单糖以及低聚糖进行定量分析，并制定党参相关的质量控制标准。其中35批党参药材中，多糖的平均质量分数为16.9%±6.0%，但不同来源的党参多糖含量差异较大，对其品质影响较大。不同品种党参多糖的单糖组成成分基本相似且含量大致相同，均含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，葡萄糖和半乳糖是党参中主要的单糖成分，可作为真伪鉴别指标。35批党参中，5种单糖和低聚糖(D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖)的总平均质量分数为19.91%，其中总含量最高的党参比最低值高达8.4倍，造成党参之间的品质差异较大。根据平均含量下浮20%的标准，建议设定党参中多糖含量质量控制标准为≥13.5%；5种糖类成分总质量分数不得低于15.92%。本文通过对主要产地和品种党参糖类成分的分析及研究，并制定相应质量控制要求，可为选择适宜品种党参作为食品原料时提供一定的数据支持。