水稻穗顶端退化突变体paa21的表型分析及基因克隆

2022-02-02赫磊路凯赵春芳姚姝周丽慧赵凌陈涛朱镇赵庆勇梁文化王才林朱丽张亚东

中国农业科学 2022年24期

赫磊，路凯，赵春芳，姚姝，周丽慧，赵凌，陈涛，朱镇，赵庆勇，梁文化，王才林，朱丽，张亚东

水稻穗顶端退化突变体的表型分析及基因克隆

1江苏省农业科学院粮食作物研究所/国家耐盐碱水稻技术创新中心华东中心/江苏省优质水稻工程技术研究中心/国家水稻改良中心南京分中心/江苏省农业生物学重点实验室，南京 210014；2中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室，杭州 310006

【】水稻穗顶端退化严重影响产量，鉴定与克隆水稻穗顶端退化相关基因，可以丰富水稻穗发育调控的分子机理，为水稻高产分子设计育种提供理论基础和基因资源。【】从粳稻品种武运粳30号EMS突变体库筛选到一份稳定遗传的穗顶端退化突变体（）。对退化一次枝梗比例、每穗退化粒数占比、每穗粒数、株高、穗长、单株产量等农艺性状进行统计。使用台盼蓝和伊文思蓝染色检测顶端小穗是否发生程序性细胞死亡。测定WT和不同发育时期幼穗和不同穗部位的H2O2含量。分别与籼稻II-32B、9311正反交进行遗传分析。利用与籼稻II-32B杂交构建的F2群体进行基因定位和克隆。使用SWISS-MODEL网站预测野生型和突变体蛋白的三维结构。利用RT-qPCR分析ROS响应标志基因、程序性细胞死亡相关基因、过氧化氢酶相关基因的表达量。突变体发生严重的穗顶端退化，统计所有一次枝梗退化情况，发现退化小穗主要位于顶端的一次枝梗上。与WT相比，的株高、每穗粒数、穗长和单株产量均降低。通过观察不同发育时期的幼穗，发现在突变体幼穗发育至12 cm时，可见穗顶端退化表型。台盼蓝和伊文思蓝染色结果表明突变体顶端小穗发生程序性细胞死亡。在退化的顶端小穗中观察到更强烈的DAB染色；H2O2含量测定结果表明，与WT相比，穗中积累更高水平的ROS。遗传分析表明突变表型受一对隐性核基因控制。图位克隆结果发现中第二外显子发生一个C到T的突变，导致丙氨酸突变为缬氨酸。该基因编码一个铝激活的苹果酸转运蛋白ALMT7。突变位点位于第4个跨膜螺旋上。SWISS-MODEL预测结果表明，该突变位点并未对突变体蛋白三维结构造成明显影响。RT-qPCR结果表明，在幼穗发育至10 cm时，中ROS响应标志基因、和，程序性细胞死亡相关基因和，过氧化氢酶编码基因、、的表达量较WT大幅升高。此外，10 cm幼穗中过氧化氢酶（CAT）的活性较WT明显下降。幼穗在发育后期顶端小穗中积累过量的ROS，产生程序性细胞死亡，最终导致顶端小穗发生退化。

水稻；穗顶端退化；活性氧；程序性细胞死亡

0 引言

【研究意义】水稻是中国重要的粮食作物，在保障国家粮食安全方面具有重要作用。水稻产量由千粒重、每穗实粒数和单位面积有效穗数决定[1]。水稻穗部发育关系到产量，水稻穗的形成涉及复杂的生理生化过程，包括分生组织发育、花序建立和籽粒发育等。深入研究水稻穗发育相关基因对提高水稻产量具有重要意义。【前人研究进展】目前，已经报道了许多与穗发育相关的重要基因，涉及幼穗发育的不同阶段，如腋生分生组织发育、分生组织之间的转化、分枝伸长和末端小穗等的调控[2]。如，突变体（）的枝梗数和每穗粒数的数量严重减少；相反，过量表达增加了枝梗和小穗的数目[3-5]。突变体（）穗子显著变大，分枝数和每穗小穗数也显著增加[6]。（）突变后分生组织活性增强，穗轴与分枝长度缩短，一次、二次枝梗数目增加[7]。（）编码一个ERF/AP2转录因子，在禾本科植物中高度保守。强突变体的穗子严重卷曲、末端小穗被更高阶的轮状分枝取代[8]。在水稻、玉米、谷子等作物的产量形成过程中，穗顶端退化对最终的产量形成有重要影响[9-11]。顶端小穗退化主要由遗传因素调控，同时也受温度和肥水等非生物胁迫的影响，是水稻生产中的重大问题之一[12-14]。目前，已经报道了一些与穗顶端退化相关的QTL，如—、、、等[14-17]。此外，利用穗顶端退化突变体已克隆数个涉及穗顶端退化的基因。（）是第一个被克隆的水稻穗顶端退化的基因，编码一个定位于细胞质的包含SHD和VCA结构域的SCAR/WAVE蛋白。与野生型相比，表现出株高变矮、叶尖枯萎、穗顶端严重退化、花药花粉发育异常等多重表型[11]。Heng等[18]利用一个穗顶端退化突变体（）克隆到一个控制穗顶端退化的显性基因。该基因编码一个具有转运苹果酸功能的质膜蛋白。细胞学分析发现，穗顶端退化是由发生在幼穗发育后期的程序性细胞死亡造成的。（）编码一个定位于线粒体的含有胱硫醚β-合酶结构域和DUF21结构域的蛋白，突变体表现为穗顶端小穗退化和穗中间小穗的育性降低。研究表明，DPS1能够与线粒体硫氧还蛋白Trx1和Trx20互作，并参与ROS清除。突变以后，突变体中脂肪酸代谢和ROS稳态相关的生物过程受到影响，从而导致穗顶端退化[19]。Peng等[20]利用一个退化率高达60%的穗顶端退化突变体（）克隆到另外一个控制水稻穗顶端退化的基因。编码一个定位于细胞质的类钙调神经磷酸酶B亚基互作蛋白激酶。的突变导致ROS在幼穗中积累，最终导致水稻穗细胞死亡产生顶端退化表型。编码一个钙氢离子交换蛋白，研究发现OsCAX1a参与Ca、Mn离子的转运，突变后导致突变体中Ca、Mn等元素含量下降，产生叶尖枯和穗部顶端退化表型[21]。【本研究切入点】目前，已克隆的水稻穗顶端退化相关基因涉及多种调控途径，但仍不能完全解释水稻穗顶端退化相关的分子机理。因此，穗顶端退化的分子机理仍需深入研究。【拟解决的关键问题】本研究以粳稻品种武运粳30号EMS诱变得到的穗顶端退化突变体为研究对象，通过对其进行表型考察、组织化学分析、遗传分析、基因定位以及基因表达分析，以期解析调控水稻穗顶端退化的分子机制，为提高水稻产量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

利用EMS（甲基磺酸乙酯）处理粳稻品种武运粳30号，田间筛选得到一份穗顶端退化的材料，经多年种植穗顶端退化表型能稳定遗传，命名为（，）。将突变体分别与籼稻9311、II-32B杂交构建F2分离群体，用于遗传分析与基因定位。

在水稻抽穗后，WT和分别取10株主穗，统计每穗退化粒数等表型。于成熟期统计株高、每穗粒数、穗长等表型。利用Excel和GraphPad Prism 8软件统计、分析数据。

1.2 台盼蓝、伊文思蓝和DAB染色

将WT和的小穗放入0.4%台盼蓝染液中，100℃染色10 min，然后，用2.5 mg·mL-1水合氯醛溶液脱色。将WT和的小穗放入0.25%伊文思蓝染液中，室温染色过夜。之后用无水乙醇脱色，扫描拍照保存。将WT和突变体小穗置于DAB染液（1 mg·mL-1）中，室温染色8 h，染色完成后使用无水乙醇脱色，扫描拍照保存。

1.3 H2O2含量、CAT酶活性测定

取不同发育时期的WT和的小穗0.1—0.2 g，按1﹕1 000比例分别加入H2O2、CAT提取液冰浴匀浆（每个样品3次重复）。8 500 r/min离心10 min，取上清放置冰上待测。分别使用苏州科铭公司的H2O2含量测定试剂盒和CAT酶活性测定试剂盒测定H2O2含量、CAT酶活性。

1.4 遗传分析及基因定位

将与籼稻II-32B、9311进行正反交，获得F1株系和F2群体，分别统计F1、F2中穗发育正常和穗顶端退化表型分离比进行遗传分析。采用CTAB法提取叶片DNA。利用水稻生物学国家重点实验室保存的均匀分布于12条染色体上的标记引物分析亲本多态性。在与籼稻II-32B构建的F2群体中选取与表型一致的植株，利用多态性好的标记对目的基因进行连锁分析。将目的基因初步定位于染色体某个区间。

利用RAP-DB（https://rapdb.dna.affrc.go.jp/）网站分析定位区间内的开放阅读框（open reading frame，ORF），在Primer-Blast网站（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast/）设计引物对WT和的候选基因测序。利用seqman软件分析测序结果。

1.5 蛋白三维结构分析

将WT和的氨基酸序列在SWISS-MODEL网站（https://swissmodel.expasy.org/）进行同源建模，分析WT和的蛋白结构。

1.6 实时荧光定量PCR

水稻组织提取RNA后，使用ReverTra Ace qPCR PCR试剂盒反转获得cDNA备用。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix和荧光定量PCR仪（Applied Biosystems 7900HT）进行RT-qPCR检测，以作为内参基因，利用2–ΔΔCt计算基因的表达量。

2 结果

2.1 paa21表型分析

2.1.1表现为严重的穗部顶端退化（，）多年种植，穗部顶端退化性状稳定，抽穗后，的顶端小穗发白、不能够正常发育、开花，在成熟期后，顶端小穗风干、脱落（图1-A—C）。统计所有一次枝梗退化情况，发现绝大多数退化小穗位于顶端一次枝梗，约35%的一次枝梗发生退化，约20%的小穗发生退化（图1-D—G）。此外，的株高低于WT，每穗粒数、穗长、单株产量均下降（图1-H—K）。

2.1.2 顶端小穗的退化发生在穗发育的后期在种植过程中，发现其顶端小穗是在幼穗发育后期产生的退化现象。为了明确顶端小穗发生退化的时期，从幼穗发育1 cm时开始观察，在幼穗生长至12 cm之前，的顶端小穗与WT没有区别（图2-A—D）。当幼穗生长至12 cm时，能够观察到明显的顶端小穗退化现象（图2-E）。随着幼穗后续不断发育至成熟，这些小穗停止发育，逐渐萎缩干瘪，在穗子成熟以后，十分容易脱落（图2-F）。

A：WT（左）和paa21突变体（右）的株型，bars=10 cm；B：WT（左）和paa21突变体（右）抽穗期的穗子，bars=2 cm；C：WT（左）和paa21突变体（右）成熟的穗子，bars=2 cm；D：来自一个穗子的一次枝梗，1—16表示paa21中从穗顶部到底部的一次枝梗。E：D图中对应枝梗的正常小穗和退化小穗统计，F：WT与paa21突变体退化一次枝梗数目所占比例；G：每穗退化粒数所占比例；H：株高；I：每穗粒数；J：穗长；K：单株产量。数据是均值±标准误；**表示t检验下显著差异（P≤0.01）。下同

A—F：WT（左）和paa21（右）穗发育不同时期的表型。依次为1、2、5、7、12和17 cm。bars=1 cm

2.2 突变体小穗发生程序性细胞死亡

由上述结果可知，的穗顶端正常发育出小穗，但是顶端小穗生长到后期的时候停止生长，种子成熟后风干脱落。据此，推断顶端小穗的细胞发生了程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。为了验证这个猜测，利用台盼蓝和伊文思蓝对WT和10—11 cm穗的顶端小穗进行染色。结果发现，与WT相比，突变体顶端小穗着色变深（图3）。表明突变体的顶端小穗发生了程序性细胞死亡。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）被认为是PCD的重要触发因素，较高浓度的ROS能够诱导植物和动物组织中的细胞死亡[22-23]。H2O2是ROS的一种，据报道，水稻穗顶部退化多数是由H2O2积累导致[18-19]。使用DAB染色检测顶端小穗中H2O2的含量。与WT相比，在退化的顶端小穗中观察到更强烈的DAB染色（图4-A），表明穗中的H2O2含量更高（图4-A）。

A：台盼蓝染色；B：伊文思蓝染色

对幼穗不同发育阶段的H2O2含量进行测定，结果表明，5 cm长的幼穗中，WT和的H2O2含量没有明显差异，但是，随着幼穗的发育，幼穗中的H2O2含量较WT逐渐升高。特别是在10和15 cm长的幼穗中（图4-B）。该结果与之前的观察结果一致，即当穗长达到12 cm时，穗顶端退化开始（图2），表明ROS水平与穗退化之间可能存在相关性。

对的10 cm幼穗不同穗部的H2O2进一步测定，与基部小穗相比，退化的顶端小穗和中间小穗的H2O2含量更高（图4-C）。表明顶端小穗中积累的过量ROS是导致其发生PCD的原因。

A：WT和paa21顶端小穗DAB染色；B：不同发育时期WT和paa21顶端小穗中过氧化氢含量的测定；C：水稻穗不同部位小穗中过氧化氢含量的测定，不同字母表示通过方差分析和LSD测试进行平均值比较的结果存在显著差异（p<0.05），ap：穗顶端部分，mp：穗中间部分，bp：穗底部

2.3 穗顶端退化性状的遗传分析及PAA21的基因定位

为了确定的显隐性以及是否受单基因控制，利用籼稻品种II-32B、9311与突变体进行杂交，所有F1植株均表现出野生型表型。F1自交产生的F2群体中出现了野生型表型和穗顶端退化的表型。通过对F2群体中野生型和突变型的个体数目进行统计，4个群体中χ2值均小于3.84，符合3﹕1的分离比（表1），表明穗顶端退化的性状由一对隐性核基因控制。

表1 paa21遗传分析

为了克隆，利用和II-32B构建的F2群体对进行定位。从F2群体中选取21个表型个体，利用本实验室保存的232对SSR、InDel标记将其初步定位于第2染色体上的标记B2-19和B2-21之间。

为进一步精细定位，利用418株单株，运用新开发的分子标记，最终将其定位于H-2-6和H-2-13之间102 kb区间内，包含11个开放阅读框（open reading frame，ORF），对其测序比对，发现基因第二外显子发生一个C到T的突变，导致丙氨酸突变为缬氨酸（图5）。RAP-DB网站注释编码一个铝激活苹果酸转运蛋白（aluminum-activated malate transporter，ALMT），是的等位基因[18]。

图5 PAA21的图位克隆

ALMT7蛋白有7个跨膜螺旋[18]，通过分析WT和蛋白氨基酸序列，结果表明，突变位点在第4个跨膜螺旋上（图6-A）。此外，利用SWISS-MODEL网站对蛋白三维结构进行分析。结果表明，第二外显子C到T的突变并未对蛋白三维结构造成明显影响（图6-B—C）。

2.4 paa21中ROS相关基因的表达受到影响

由于的穗中积累大量的ROS，为了研究ROS产生的分子效应，对3个ROS响应标志基因、和的表达进行分析。这些基因属于WRKY转录因子家族，在水稻、拟南芥中受ROS的强烈诱导表达[24-25]。在幼穗发育至10 cm时，中3个基因的表达量较WT大幅升高（图7-A—C）。

、编码液泡加工酶（vacuolar processing enzymes，VPE），是植物程序性细胞死亡的关键调控因子[26-27]。RT-qPCR结果表明，幼穗发育至10 cm时，中和的表达量较WT显著升高（图7-D—E）。

、、编码过氧化氢酶，过氧化氢酶能够催化H2O2形成H2O和O2，在ROS清除系统中发挥重要作用。检测发育至5和10 cm的幼穗中这3个基因的表达情况。结果表明，5 cm幼穗中，3个基因在突变体和WT之间的表达量相似（图7-F—H）。而在10 cm幼穗中，3个基因的表达量较WT明显上升（图7-F—H）。

此外，还对10 cm幼穗中过氧化氢酶（CAT）的活性进行了测定。发现中CAT的活性明显下降。说明突变体中ROS的清除能力下降（图7-I）。

M1—M6表示PAA21蛋白的跨膜螺旋结构，红框指示突变位点

综上所述，幼穗在发育后期顶端小穗中积累过量的ROS，产生程序性细胞死亡，最终导致顶端小穗发生退化。

3 讨论

3.1 paa21是paab1-1新的等位突变体

水稻穗顶端退化会造成产量上的损失。迄今为止，已经报道了多个导致水稻穗部顶端退化的基因，如、、、、、和[11, 18-20, 28-31]。这些基因涉及内质网应激、营养物质运输、ROS稳态调节等多个生理过程，颖花退化的分子机制和生理机理还有待进一步丰富[32]。

本研究在EMS突变体库中筛选获得一个以武运粳30号为背景的穗顶端退化突变体。的穗顶端会发生严重的退化现象，导致其穗子变短、每穗粒数减少、单株产量下降（图1）。退化小穗数占每穗总颖花数的比例约为20%，退化小穗主要分布在穗顶端，并且处于穗轴上部的一次枝梗退化的颖花占比大（图1）。发现的幼穗发育到12 cm时，顶端小穗发生退化，表明参与维持水稻穗发育（图2）。遗传分析结果表明，表型受一对隐性核基因控制（表1）。基因定位结果表明，突变体在的第二个外显子中具有单核苷酸替换（C突变A），导致在PAA21第129个残基处丙氨酸（Ala）被缬氨酸（Val）替换，但并没有造成蛋白三维结构发生明显改变（图5和图6）。编码一个铝激活的苹果酸转运蛋白，预测有7个跨膜螺旋。的突变位点在第4个跨膜螺旋上（图6-A），推断该突变可能导致跨膜结构改变，无法正常转运苹果酸，产生了穗顶端退化的表型。

图7 活性氧、PCD相关基因的表达量及过氧化氢酶活性

RA-PDB网站注释编码一个铝激活的苹果酸转运蛋白OsALMT。Heng等[18]利用以Kittake为背景的穗顶端退化突变体研究了该基因通过参与苹果酸的转运维持穗发育的功能，并将其命名为。因此，是新的等位基因。与本研究不同的是，是一个显性突变，而本研究中的则是一个隐性突变。的突变位点位于第二个内含子和第三个外显子之间的剪接位点，导致mRNA剪接发生改变，产生了2种错误的转录本[18]。而的突变位点则是第二外显子上，仅造成一个氨基酸的替换。此外，彭永彬[33]利用穗顶端退化突变体，与本研究类似，也是一个隐性突变。在第三外显子上发生了一个单碱基替换，导致对应编码氨基酸由精氨酸变为赖氨酸。因此，、和中显隐性的差异可能是突变方式不同导致的。

3.2 ROS过度积累引起的PCD是paa21穗顶端退化的原因

活性氧是PCD的重要触发因素，ROS的过度积累使细胞膜高度氧化，进而影响细胞通透性，最终导致细胞死亡[23, 34-35]。本研究台盼蓝和伊文思蓝染色结果表明，顶端退化小穗中发生了PCD（图3）。DAB染色、H2O2含量测定发现，顶端退化小穗中积累了大量的ROS（图4）。此外，穗部的PCD相关基因和ROS清除相关基因的表达水平显著增加，过氧化氢酶的活性也大幅下降（图7）。结果表明，由于ROS在穗顶端的过度积累而引起的PCD可能是穗顶端退化的原因。综上所述，推测的突变导致ROS过度积累，最终诱导细胞死亡。

4 结论

EMS诱变获得一个水稻穗顶端退化突变体，突变表型受一对隐性核基因控制，为突变所致。穗发育后期积累大量ROS，诱导细胞死亡，产生穗顶端退化表型。

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Phenotypic analysis and gene cloning of rice panicle apical abortion mutant

HE Lei1, LU Kai1, ZHAO ChunFang1, YAO Shu1, ZHOU LiHui1, ZHAO Ling1, CHEN Tao1, ZHU Zhen1, ZHAO QingYong1, LIANG WenHua1, WANG CaiLin1, ZHU Li2, ZHANG YaDong1

1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/East China Branch of National Center of Technology Innovation for Saline-Alkali Tolerant Rice/Jiangsu High Quality Rice R&D Center/Nanjing Branch of China National Center for Rice Improvement/Key laboratory of Jiangsu Province for Agrobiology, Nanjing 210014;2China National Rice Research Institute/State Key Laboratory of Rice Biology, Hangzhou 310006

Rice panicle apical abortion affects yield. Identification and cloning of genes related to rice panicle apical abortion can enrich the molecular mechanism of rice panicle development regulation, and provide theoretical basis and genetic resources for rice high-yield molecular design breeding.Here, a stably inherited() mutant was screened from EMS mutant library of the japonica rice variety "Wuyunjing 30". Agronomic traits, such as ratio of degraded primary branches, degraded apical spikelets, grains per panicle, plant height, panicle length, and grain yield per plant, were statistically analyzed. Trypan blue and Evans blue staining were used to detect whether programmed cell death occurred in the apical spikelets. H2O2content in young panicles at different development stages and different panicle parts of WT andwas determined. Genetic analysis was carried out by reciprocal cross ofwith indica rice II-32B and 9311 respectively. The F2population constructed by crossingwith indica rice II-32B was used for gene mapping and cloning. The three-dimensional structure of wild-type andproteins were predicted using SWISS-MODEL website. The expression levels of ROS response marker genes, programmed cell death related genes and catalase related genes were analyzed by RT-qPCR.produced panicle apical abortion phenotype and the degenerated spikelets were mainly located on the primary branches at the apical panicle. The plant height, grain number per panicle, panicle length and grain yield per plant ofwere lower than those of WT. After observing the young panicles at different development stages, we found that themutant had a panicle apical abortion phenotype when panicle developed to 12 cm. Trypan blue and Evans blue staining results showed that the apical spikelets of themutant had programmed cell death. Stronger DAB staining was observed in the degenerated apical spikelets ofthan WT. The results of H2O2content determination showed that higher level of ROS was accumulated in panicle ofcompared with WT. Genetic analysis suggested thatmutant phenotype is controlled by a pair of recessive nuclear genes. The results of map-based cloning showed that a C to T mutation occurred in the second exon of, resulting in the mutation of alanine to valine. This gene encodes an aluminum activated malate transporter, ALMT7. The mutation site was located at the fourth transmembrane helix. SWISS-MODEL prediction results showed that the mutation site did not significantly affect the three-dimensional structure of the mutant protein. The expression level of ROS response marker genes,andwas significantly higher than that in WT when the young spike developed to 10 cm. Compared with WT, the expression level of programmed cell death related genesandincreased significantly in. The expression level of,andwhich encode catalase in 10 cm young panicle ofwas significantly higher than that of WT. The activity of CAT in10 cm young spikelet was significantly lower than that of WT.accumulate excess ROS in the apical spikelet at late stage of panicle development, resulting in programmed cell death, which eventually leads to the degeneration of the apical spikelet. These results lay a good foundation for further enriching the genetic regulatory network of panicle development.

rice; panicle apical abortion; reactive oxygen species; programmed cell death