香水柠檬RHF2A的克隆与互作蛋白的筛选

2022-02-02李雨泽朱嘉伟林蔚蓝茉莹夏黎明张艺粒罗聪黄桂香何新华

中国农业科学 2022年24期

李雨泽，朱嘉伟，林蔚,2，蓝茉莹，夏黎明，张艺粒，罗聪，黄桂香，何新华

香水柠檬的克隆与互作蛋白的筛选

1广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/植物科学国家级实验教学示范中心，南宁 530004；2福建省农业科学院亚热带农业研究所，福建漳州 363005

以香水柠檬（(L.) Burm. F.）为研究对象，分析两个的时空表达规律，利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补试验（BiFC）筛选、验证其互作蛋白，为深入研究在香水柠檬自交不亲和过程中的分子作用机制奠定基础。从前期转录组和泛素修饰组（未公开）筛选获得2个E3泛素连接酶RHF2A（RING-H2 Zinc Finger2A）基因-1、-2，并克隆其全长序列，通过生物信息学分析2个的序列和蛋白质结构，预测其启动子顺式作用元件，构建35S-RHF2A-GFP融合蛋白表达载体用于亚细胞定位分析，采用实时荧光定量PCR分析两个的时空表达模式，构建酵母双杂诱饵载体从香水柠檬酵母文库筛选互作蛋白。构建BiFC载体，在洋葱活体细胞内对目标蛋白进行互作验证。从香水柠檬克隆获得、，ORF全长分别为1 161和1 134 bp；NCBI结构域预测发现其具有Ring/U-box结构域。启动子分析发现其具有花粉特异性表达相关元件POLLEN1LELAT52、GTGANTG10。组织表达分析发现在花粉特异性表达，在叶中特异性表达；时空表达分析结果显示，在自交柱头表达量从第1天开始升高，第3天达到峰值，是杂交柱头表达量的5倍以上。亚细胞定位显示RHF2A-1和RHF2A-2定位在细胞核。经过Uniprot网站预测其互作蛋白显示RHF2A能与KRP6、AT3G57370、UBA1、FBL17、SK11蛋白相互作用，推测其参与自交不亲和泛素化反应途径、配子体发育调控、花粉的生长发育等生物学过程。通过酵母双杂交技术筛选出72个克隆，对其测序并进行Blast比对后排除重复克隆，最终得到ABCF3等20个候选互作蛋白。经过一对一互作验证、双分子荧光互补实验确定RHF2A-1与ABCF3-2存在互作关系。的时空表达规律与自交不亲和过程中花粉在雌蕊上的萌发规律相吻合；筛选得到柠檬授粉过程中直接影响花粉生长发育的互作候选蛋白，初步证明在自交不亲和过程中具有重要作用。

香水柠檬；RHF2A；基因克隆；时空表达；酵母双杂交技术

0 引言

【研究意义】自交不亲和（self-incompatibility，SI）是植物遗传过程中一种常见的现象，雌蕊和雄蕊能够正常发育，但没有自花授粉结实的功能，有效避免了近亲繁殖，从而保证了遗传多样性。已证实香水柠檬的无籽特性是由配子体自交不亲和引起[1-2]，配子体自交不亲和性的花粉能在柱头上萌发，但在花粉管中延伸后遭到抑制。在配子体自交不亲和反应中，除了和影响自交不亲和特性外[3]，泛素化降解途径也是影响自交不亲和的重要因素。已有较多研究报道，SCF复合体泛素途径降解RNA酶是较为公认的花粉识别机制，是影响自交不亲和作用的重要途径。目前有关影响自交不亲和作用的非S基因研究相对较少，课题组前期从香水柠檬泛素修饰组中发掘得到，拟南芥的与自交不亲和相关，香水柠檬是否与自交不亲和相关尚不清楚，研究探明香水柠檬的表达调控模式及其与其他基因之间的互作关系，有助于深入研究其参与自交不亲和的调控机理。【前人研究进展】Ring finger蛋白家族是E3泛素连接酶中的重要组成部分[4]，涉及植物中重要的泛素化途径[5]，其中编码的E3泛素连接酶蛋白具有Ring/U-box结构域并参与蛋白质泛素化的途径。在拟南芥中，、的双突变体会导致雌雄配子体发育受阻，、的功能缺失会导致细胞周期的负调控因子泛素化降解受到抑制，使其蛋白积累增多，造成配子发育受阻的现象[6-7]；研究发现，拟南芥具有Ring/U-box保守结构域的Ring finger E3泛素连接酶ARC1是SRK激酶的下游信号传递因子，在结合底物后能与同源的E2互作，将底物泛素化降解后导致自交不亲和[8-10]；SAMUEL等[11]发现S位点的受体激酶与具有Ring/U-box结构域的ARM蛋白相互作用，是导致自交不亲和的成因；与蜜柚CgRHF1同源的蛋白AtXERICO能与UBC8（泛素结合酶8）、ASK1- interacting F-box protein（TLP9）、At2g31470（F-box 家族蛋白）等互作[10]，且该基因有可能影响SCF复合体的合成，保持S-RNase的核酸酶活性，从而降解花粉管中的RNA，抑制花粉管生长，最终导致自交不亲和反应。李慧敏等[12]在沙田柚中克隆得到一个，推测其可能在自交不亲和泛素识别底物过程中扮演重要角色。唐文武等[13]从无籽、有籽砂糖橘中克隆出CrU-box基因，比较该基因在无籽、有籽砂糖橘中的差异，初步推测无籽砂糖橘突变以及自交授粉后高水平表达可能是导致自交不亲和形成的原因之一。【本研究切入点】前人研究发现编码的E3泛素连接酶蛋白具有Ring/ U-box结构域并参与蛋白质泛素化的途径，RHF2A蛋白可能在对果实发育、逆境胁迫、配子体发育等方面发挥作用，无籽砂糖橘、沙田柚与自交不亲和相关，香水柠檬具有自交不亲和特性，前期从香水柠檬泛素修饰组筛选出中2个具有Ring/U-box结构域，但这2个基因是否与自交不亲和相关尚不清楚，有待深入研究。【拟解决的关键问题】克隆、，研究其组织表达和时空表达特性，探明这2个基因表达规律；构建酵母双杂交诱饵载体，从香水柠檬酵母文库筛选互作蛋白并进行验证，构建BiFC表达载体，在洋葱活体细胞内进行互作验证，初步明确互作关系；综合分析鉴定该基因是否真正参与泛素化进而参与自交不亲和作用，为深入研究在香水柠檬自交不亲和过程中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

试验于2021—2022年在广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室进行。

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料对种植于广西大学农学院果园的8年生香水柠檬植株的花去雄，进行自交授粉处理（香水柠檬♀×香水柠檬♂）和杂交授粉处理（香水柠檬♀×白花柠檬♂）并套袋。采集香水柠檬自交后和杂交后0、10 h、20 h、1 d、2 d、3 d、4 d的柱头、花柱、子房样品及各组织样品（叶、柱头、花柱、子房、花药、花丝、花瓣、花托），采集的样品立即放入-80℃冰箱中冻存备用。

1.1.2 试验试剂及载体高保真酶（武汉全式金公司），X-α-Gal、AbA，荧光定量PCR专用酶（大连TaKaRa公司），DNA胶回收试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒、克隆载体pDM18-T、dNTP（上海生工生物工程股份有限公司），Marker（广西南宁壹棵松生物科技有限公司），酵母质粒提取试剂盒（北京天根生物公司）。

1.2 RHF2A的克隆与生物信息学分析

采用HiPure HP Plant RNA MiNi Kit RNA提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司）提取香水柠檬花器官RNA，保存在-80℃冰箱，根据反转录试剂盒（大连TaKaRa公司）说明书合成cDNA。根据从香水柠檬泛素修饰组和转录组[14]挖掘出的两个参与泛素化的序列设计引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，回收符合预期的条带并纯化，将纯化后的胶回收产物与pMD18-T载体连接转入大肠杆菌感受态DH5α（武汉全式金公司），涂板后对菌落进行PCR检测，送至广州擎科生物公司测序。

使用BioXM2.6软件将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，从NCBI上Protein BLAST获得其他物种的同源氨基酸序列，DNAMAN6.0进行序列比对和MAGA6构建进化树，使用NCBI CD-Seach进行保守结构域预测，利用Uniprot网站预测RHF2A互作蛋白，ExPASy预测蛋白质理化性质，利用IBS制作核苷酸结构图。

通过PLACE和PlantCARE在线数据库分析预测RHF2A-1和RHF2A-2启动子顺式作用元件后，用TBtools[15]进行可视化分析。

1.3 RHF2A表达模式分析

明确在香水柠檬自交、杂交授粉后不同时段和在雌蕊不同组织中的表达模式，以及在香水柠檬不同花组织中的表达模式。根据、序列设计特异性引物（表1），通过qRT-PCR对、的表达量进行检测。反应体系及程序参照WANG等[16]，以[17]为内参基因，采用2-ΔΔCT方法对数据进行整理[18]。使用IBM SPSS Statistics 24.0进行数据处理。

1.4 RHF2A的亚细胞定位

采用pBI221载体，去掉目的基因序列的终止密码子后采用双酶切法（H I和I）构建pBI221---EGFP和pBI221---EGFP载体（武汉金开瑞生物工程有限公司），以pBI221-EGFP载体为对照，同时进行转化农杆菌感受态EHA105（上海昂羽生物公司）。采用新鲜洋葱进行亚细胞定位，具体方法参照刘海燕等[19]。

1.5 酵母感受态的制备及自激活检测

按照Y2HGold/Y187酵母感受态（上海昂羽生物公司）说明书转化载体。用1 mL ddH2O重悬，吸取100 μL涂布在相应的缺陷培养基（SD/-Trp；SD/-Leu），29℃倒置培养48—96 h。

挑取单菌落，用相应的液体培养基（SD/-Trp；SD/-Leu）培养24—36 h，PCR检测验证后加入同等体积的酵母冻存液（YPDA液体培养基﹕甘油比例= 3﹕1），保存于-80℃用于后续试验。

表1 PCR引物列表

将制备好的pGBKT7-RHF2A-1、pGBKT7-RHF2A- 2稀释1/10、1/100、1/1000后吸取100 μL分别涂布在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal（-Trp/X，X-α-Gal浓度为200 ng·mL-1）、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA（-Trp/X/A，AbA浓度为500 μg·mL-1），在30℃倒置培养3—5 d后观察菌落生长状态。

1.6 酵母双杂交筛选互作蛋白

酵母双杂交试验按照MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System User Manual（TaKaRa）操作手册进行，酵母双杂交试验使用文库为前期实验室构建的香水柠檬均一化cDNA文库，具体步骤参照操作手册进行。挑取菌斑，采用T7/3AD引物进行PCR鉴定，反应程序参照WANG等[16]。将产物测序，经NCBI比对测序结果，挑选重要互作蛋白加入酵母冻存液，置于-80℃保存。

1.7 互作候选基因组织表达分析

对通过酵母双杂交筛选出的重要互作蛋白进行组织表达分析，具体方法同1.3。

1.8 候选Prey蛋白一对一验证

提取筛选出的重要蛋白的酵母质粒，转入感受态DH5α，涂布在LB固体培养基上，37℃培养12—16 h，挑取培养基上的单菌落进行PCR鉴定，再提取大肠杆菌质粒（pGADT7-prey）。

参照1.5方法，将Bait质粒与Prey质粒分别共转入Y2H Gold/Y187酵母感受态细胞中，挑单菌落用2×YPDA液体培养基在30℃过夜共培养。用枪头吸取7 μL点在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X/A（Q/X/A）固体培养基上，倒置放入30℃培养箱中培养3—5 d，观察菌落生长状况。

1.9 双分子荧光互补试验

参照GV3101感受态（上海昂羽生物公司）转化说明书，将puc-sPYNE-RHF2A-1、puc-sPYCE-ABCF3-2载体转入GV3101感受态。将活化后的目的基因接种到LB液体培养基（含相应抗生素）中，28℃振荡培养过夜，摇浓后按1﹕1等体积混合培养1 d。将摇浓的菌液8 000 r/min离心5 min弃上清液，加MS液体培养基（含乙酰丁香酮和MgCl2）稀释至OD600=0.7— 1.0为最佳。将新鲜洋葱表皮放到混合液中侵染20—30 min，取出洋葱表皮平铺于MS固体培养基，光照培养16 h后在共聚焦扫描显微镜中观察荧光[20]。

2 结果

2.1 香水柠檬RHF2A的cDNA克隆与序列分析

2.1.1的cDNA克隆与序列分析根据香水柠檬泛素修饰组和转录组挖掘出的两个参与泛素化的，分别命名为、-2。基因序列设计克隆引物，以香水柠檬的cDNA为模板扩增出两条长度约为1 100 bp的条带（图1），测序分析其开放阅读框长度分别为1 161 bp和1 134 bp，、-2的核苷酸相似性为65.55%，与香水柠檬基因组（未公开）中的和-2序列一致，RHF2A-1和RHF2A-2分别编码386个氨基酸和378个氨基酸，RHF2A-1、RHF2A-2的氨基酸相似性为58%，RHF2A-1、RHF2A-2编码蛋白的理化性质见表2，两个基因编码的蛋白不稳定系数都大于40，均为不稳定蛋白，且总平均亲水性都为负值，预测该蛋白为亲水蛋白。

2.1.2 RHF2A系统进化树分析从柑橘基因组数据库和NCBI下载RHF2A-1和RHF2A-2同源氨基酸序列，构建RHF2A系统发育进化树显示，RHF2A-1和RHF2A-2分为两类，且都与克里迈丁橘（）、甜橙（）RHF2A的聚类最近（图2）。

根据香水柠檬染色体注释信息，通过MG2C在线软件绘制香水柠檬在染色体中的定位图；IBS制作DNA结构图。结果显示，-和-分别定位在8号和4号染色体上，都同样具有7个内含子和6个外显子（图3）。

图1 RHF2A-1和RHF2A-2电泳图

表2 RHF2A-1和RHF2A-2蛋白理化性质分析

图2 RHF2A同源基因氨基酸系统发育进化树

A：基因在染色体上的定位图；B：DNA结构图；圆柱形表示外显子，横线表示内含子

2.2 启动子顺式元件分析

利用PLACE和PlantCARE在线软件分别预测-、-ATG上游-2.0 kb区域的启动子顺式作用元件。结果显示，两个启动子序列都包含两个相同的花粉基因特异性表达相关元件：GTGANTG10、POLLEN1LELAT52，而花粉基因特异性表达相关元件AAATGA只存在于-的启动子中[20-21]。除此之外，还存在赤霉素响应元件、细胞分裂素响应元件、生长素响应元件、茉莉酸响应元件等激素相关的顺式作用元件（图4）。

图4 RHF2A-1和RHF2A-2启动子顺势元件分析

2.3 RHF2A-1和RHF2A-2表达模式分析

通过实时荧光定量测定两个基因在花药、花丝、柱头、花柱、子房、花瓣、花托、叶中的表达量。结果显示，-在花药中特异表达，-在叶中特异性表达（图5），说明-可能与花粉发育有关。

-在自交授粉1 d时的柱头中的表达量开始上升，到第3天时达到一个最大值，是0 h的5倍以上。杂交授粉中-不同时段表达差异不明显，且表达量低于自交授粉；自交授粉在花柱中1 d时达到峰值，且是0 h段杂交授粉表达量的60倍以上；在子房中，自交授粉和杂交授粉的表达量呈下降趋势，且趋势也大致相同。-在自交授粉和杂交授粉柱头和花柱中表达差异小，且随时间表达变化小；子房中-表达量呈上升趋势，但与杂交授粉表达差异不大（图6）。以上结果说明，-很可能参与自交不亲和作用。

不同小写字母表示0.05水平差异显著。下同 Different lowercase letters represent significant difference at 0.05. The same as below

A、B、C分别为柱头、花柱、子房的基因时空表达模式

2.4 RHF2A-1和RHF2A-2蛋白的亚细胞定位

通过农杆菌介导法将构建的ClRHF2A-1-GFP和ClRHF2A-2-GFP融合表达载体瞬时表达于洋葱表皮细胞。在荧光共聚焦显微镜下，观察到两个基因均定位在细胞核上（图7）。

2.5 诱饵载体构建和自激活检测

转化酵母RHF2A-1、RHF2A-2在SD/-Trp上正常生长为粉色，在SD/-Trp/X-α-gal上正常生长为粉色，在SD/-Trp/X-α-gal/AbA上不生长（图8），说明RHF2A-1、RHF2A-2不自激活，可以进行下一步试验。

图7 RHF2A-1和RHF2A-2蛋白在洋葱中的亚细胞定位分析（标尺=100 μm）

图8 RHF2A-1和RHF2A-2蛋白的自激活检测

2.6 酵母双杂交筛选互作蛋白及互作候选蛋白的功能注释

将Bait酵母与文库混合培养，涂布在QDO（SD/ -Leu/-Trp/-His/-Ade）培养基上，分别长出72和14个克隆，再挑单菌落在Q/X/A（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/ X-α-gal/AbA）固体培养基上划线扩大培养，将在平板上变蓝的菌斑进行PCR鉴定后测序，排除重复克隆后挑选重要克隆列出如表3，将第二次筛选得到的重要克隆接种到Q/X/A固体培养基上进行第3次筛选，RHF2A-1筛选到20个阳性克隆，RHF2A-2筛选得到8个阳性克隆（图9）。

将28个阳性克隆的PCR产物测序，将测序结果利用NCBI进行Blast比对分析，RHF2A-1筛选结果包括S-腺苷甲硫氨酸合酶2（adenosylmethionine synthase 2）、赤霉素受体GID1B（gibberellin receptor GID1B）、异质核核糖核蛋白1（ribonucleoprotein 1）、E3泛素蛋白连接酶RGLG2（E3 ubiquitin-protein ligase RGLG2）、bZIP转录因子17（bZIP transcription factor 17）、天冬氨酸蛋白酶A1（aspartic proteinase A1）、茎特异蛋白TSJT1（stem-specific protein TSJT1）、水稻开花位点T1（RICE FLOWERING LOCUS T 1）、苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase）、天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinase）、FBA6、RING-H2 finger protein ATL39、ABCF3转运蛋白（ABC transporter F family member 3）、AP-1 complex subunit mu-2、KH结构域蛋白HEN4（KH domain-containing protein HEN4）、SEC10b、TBCC、蛋白磷酸酶2C 56（protein phosphatase 2C 56）。利用网站Uniprot分别对候选蛋白进行Gene Ontology（GO）注释，结果如表3所示，20个互作候选蛋白分别具有激素调节、影响花粉发育、花粉管伸长、泛素连接酶活性、泛素结合酶活性、氧化还原酶活性、花期调控、物质跨膜运输、细胞形态发生等生物功能。特别筛选到ABCF3转运蛋白与S-RNase跨膜运输有关，而S-RNase是自交不亲和的关键酶。

图9 生长在DDO或QDO/X/A平板上的阳性克隆（A与B分别为RHF2A-1和RHF2A-2的筛选结果）

RHF2A-2筛选结果包括糖蛋白葡萄糖基转移酶（UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase）、液泡相关蛋白13F（sorting-associated protein 13F）、bZIP转录因子17（bZIP transcription factor 17）、生长素诱导蛋白PCNT115（auxin-induced protein PCNT115）、光系统II反应中心PSB28蛋白（photosystem II reaction center PSB28 protein）、AP-1 complex subunit mu-2、30S核糖体蛋白3-1（30S ribosomal protein 3-1）、蛋白质LEO1同系物（protein LEO1 homolog）、probable ubiquitin-conjugating enzyme E2 C、S-腺苷甲硫氨酸合酶 2（S-adenosylmethionine synthase 2）。8个互作候选蛋白分别具有激素调控、花期调控、泛素结合酶活性等生物功能（表4）。

2.7 互作候选基因组织表达分析

筛选得到的ABCF3候选蛋白属于跨膜蛋白，与S-RNase 跨膜运输有关。孟冬[22]在苹果中发现MdABCF（MDP0000170302）与S-RNase存在互作关系，参与S-RNase的跨膜运输，协同调控苹果自交不亲和反应。通过序列对比发现与为同源基因，进一步从香水柠檬全基因组中找到5个，分别命名为、、、、，互作候选蛋白ABCF3与ABCF3-2序列一致。qRT-PCR结果表明，、在花药中特异性表达，在雌蕊中相较于叶、花瓣、花萼则高表达（图10）。

2.8 RHF2A与ABCF一对一互作验证

从香水柠檬全基因组中得到、、、序列，构建pGADT7-Prey载体，转入Y187酵母感受态，30℃培养3—5 d，挑取单菌落与诱饵酵母共培养后在Q/X/A上点板验证。结果显示RHF2A-1与ABCF3-2互作，其余均不互作（图11）。

2.9 双分子荧光互补试验验证RHF2A-1与ABCF3-2相互作用

构建双分子荧光互补载体 puc-sPYNE-RHF2A-1、puc-sPYCE-ABCF3-2，阴性对照为puc-sPYNE-RHF2A- 1+puc-sPYCE-empty，结果如图12所示。在RHF2A-1与ABCF3-2共转化后洋葱的细胞核中检测到强烈的YFP荧光信号，而在puc-sPYNE-RHF2A-1+puc-sPYCE- empty中没有观察到YFP荧光。证明RHF2A-1与ABCF3-2之间存在互作关系。

表3 RHF2A-1所有候选蛋白信息

3 讨论

自交不亲和是花粉经过花柱表面识别后，通过花粉管沿着花柱生长完成双受精过程中受到影响而不能完成双受精过程所导致。因此，花粉沿着花粉管向下延伸的过程中能否正常生长发育在自交不亲和作用中是至关重要的影响因素。

图10 ABCF的组织表达分析

图11 ClRHF2A-1与ClABCF蛋白的一对一互作验证

表4 RHF2A-2所有候选蛋白信息

图12 在洋葱中用BiFC方法验证RHF2A-1与ABCF3-2互作（标尺=100 μm）

3.1 RHF2A-1 和RHF2A-2 的基因序列分析

在拟南芥中，是作用于细胞周期的调控因子，参与配子体的形成和发育，功能缺失会引起配子体发育受阻，从而影响花粉正常发育[8]。从授粉后的香水柠檬雌蕊泛素修饰组中发掘得到的、在多种植物中高度保守，且在N端具有稳定的Ring/U-box结构域。分析其启动子顺势元件发现，和都包含在花粉中特异性表达相关元件POLLEN1LELAT52[23-24]、GTGANTG10[25]，启动子含有AAATGA花粉特异性表达元件，而中未发现。推测可能在花粉中特异性表达，参与到花粉的生长发育。除此之外，启动子部分包含各类激素响应元件，这表明该基因可能受到多种激素影响。前人研究中，IAA和GA3对花粉管的生长具有促进作用，而ABA可以抑制花粉管生长[26-28]。但有关激素与香水柠檬表达的关系尚不清楚，有待深入研究。

3.2 RHF2A-1和RHF2A-2的表达模式分析

在花药中特异性表达，且表达量至少为其他组织表达量的9倍，推测该基因极有可能参与花粉发育。而在叶中特异性表达，且在雌雄蕊表达没有显著性差异，可能与自交不亲和的关系较小。ZHANG等[29]的研究结果表明，自花和异花授粉的花粉在柱头上都能够萌发，并且能够向下延伸，但24 h后在柱头下部卷曲，最终不能到达子房，本研究进行的时空表达模式分析结果与其相吻合。在柱头中，的表达量在1 d的时候上升趋势显著，在第3天达到一个峰值，在所有时间段自交授粉的表达量显著高于杂交授粉。在花柱中，表达量在1 d时显著上升到一个峰值，大约为0 h的60倍以上。而在子房中，该基因的表达量随时间的变化，与杂交授粉表达量的变化趋势没有显著性。该结果与Zhang等[29]的研究结果规律一致。而的时空表达模式与授粉后花粉生长模式不相符，在柱头和花柱中的表达量随时间变化趋势不明显，且在自交授粉和杂交授粉中表达无显著性差异。因此，推测极大可能参与花粉在授粉过程中的生长发育，从而引起自交不亲和。

3.3 RHF2A-1和RHF2A-2互作蛋白的筛选及验证

ABC转运蛋白是一类跨膜运输蛋白，在苹果中MdABCF被证实参与S-RNase的跨膜运输并与其相互作用，从而参与自交不亲和作用[30]。吕换男等[31]通过对亲和的‘金坠’梨和不亲和的‘鸭梨’进行蛋白质组学分析，筛选出6个与自交不亲和相关的ABC转运蛋白。贺丹等[32]发现在芍药远缘杂交中与内源激素有关，可能诱导激素发生变化，进而影响花粉发育。CHOI等[33]发现能促进花粉壁的形成，Cecchetti等[34]发现参与花药的形成，且在其中起协同作用。本研究筛选到的与苹果中为同源基因，序列相似度为83%，在香水柠檬花粉中的特异性表达结果也与在苹果中的表达模式一致，的作用很可能与在苹果中的作用相同，参与S-RNase的跨膜运输。且在泛素修饰组中发现了，说明同样参与了泛素途径。因此，推测RHF2A-1与ABCF3-2相互作用，很可能在泛素化过程中协助ABCF3-2转运大分子物质，但其调控机理还需进一步深入研究。

4 结论

通过前期泛素修饰组和转录组筛选克隆得到两个，该基因具有稳定的Ring/U-box结构域。在启动子部分发现含有花粉中特异性表达相关元件AAATGA，而启动子中不含有该元件。在花药中特异性表达；时空表达模式分析发现在自交授粉的柱头和花柱中表达量显著高于杂交授粉，子房中无明显表达差异。利用RHF2A-1筛选得到20个候选蛋白，包括S-腺苷甲硫氨酸合酶、L-抗坏血酸氧化酶同系物、天冬氨酸蛋白酶、ABCF转运蛋白1、TBCC等。RHF2A-1与ABCF3-2存在互作关系，RHF2A-1很可能参与到ABCF3-2的转运过程中，共同调控花粉的生长发育及影响自交不亲和大分子物质跨膜运输过程。

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Cloning and Interaction Protein Screening ofGene from Xiangshui Lemon

1College of Agriculture, Guangxi University/State Key Laboratory of Subtropical Agricultural Biological Resources Protection and Utilization/National Experimental Teaching Demonstration Center of Plant Science, Nanning 530004;2Institute of Subtropical Agriculture, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou 363005, Fujian

Xiangshui lemon ((L.) Burm. F.) was used to study the expression of twogenes, and to screen and verify their interaction proteins by yeast two-hybrid technology and BiFC, so as to lay a foundation for further studying the molecular mechanism ofin the process of lemon self-incompatibility.Two E3 ubiquitin ligase(RING-H2 Zinc Finger2A) genes includingandof Xiangshui lemon were screened from the transcriptome and ubiquitin modification group, and their full-length sequences were cloned. The sequence and protein structure of twogenes were analyzed by bioinformatics to predict the cis acting elements of their promoters. 35S-RHF2A-GFP fusion protein expression vector was constructed for subcellular localization analysis. The temporal and spatial expression patterns of twowere analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. The yeast two-hybrid bait vector was constructed to screen the interaction proteins from the lemon yeast library. The BiFC vector was constructed to verify the interaction of the target protein in onion living cells.Theandgenes were obtained from ‘Xiangshui’ lemon, and the total length of ORF was 1 161 and 1 134 bp, respectively. NCBI domain prediction found that it had a Ring/U-box domain. Promoter analysis showed that there were POLLEN1LELAT52 and GTGANTG10 related to pollen specific expression elements. Tissue expression analysis showed thatgene was specifically expressed in pollen andwas specifically expressed in leaves; the results of temporal and spatial expression analysis showed that the expressed ofgene was involved in biological processes such as self-incompatibility ubiquitination reaction pathway, gametophyte development regulation and pollen growth and development. 72 clones were screened by yeast two-hybrid technology. After sequencing and blast comparison, the repetitive clones were excluded. Finally, 20 candidate interaction proteins such as ABCF3 were obtained. Through one-to-one interaction verification and BiFC, it was determined that there was an interaction relationship between RHF2A-1 and ABCF3-2.The temporal and spatial expression ofgene was consistent with the germination of pollen on pistil in the process of self-incompatibility; the interaction candidate proteins directly affecting pollen growth and development during the pollination were screened, which preliminarily proved thatgene played an important role in the process of self-incompatibility.

lemon; RHF2A; gene cloning; spatiotemporal expression; yeast two hybrid technology