牛筋草EPSPS酶联免疫试剂盒的研发及应用

2022-02-02李志玲李香菊崔海兰于海燕陈景超

中国农业科学 2022年24期

李志玲，李香菊，崔海兰，于海燕，陈景超

李志玲，李香菊，崔海兰，于海燕，陈景超

中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193

克隆牛筋草（）中草甘膦的靶标基因，获得牛筋草EPSPS重组蛋白并制备其单克隆及多克隆抗体，组装酶联免疫试剂盒，检测牛筋草植株不同组织的表达水平及蛋白含量，为快速鉴定抗性牛筋草提供简便工具。利用PCR方法克隆基因全长；构建pET30a-EPSPS阳性质粒并转化宿主菌BL21，经IPTG诱导表达后获得重组蛋白；利用该重组蛋白免疫小鼠与新西兰大白兔，制备单克隆及多克隆抗体，并利用Western blot检测特异性；利用间接ELISA方法进行免疫配对试验，筛选出最佳配对抗体，优选各试剂工作浓度并组装试剂盒；用研制的试剂盒对不同种群牛筋草进行EPSPS含量检测，并与qPCR结果分析比较。牛筋草的开放阅读框含有1 620 bp的核苷酸，编码540个氨基酸，理论等电点为8.80，该蛋白无跨膜区域。进化树分析结果表明牛筋草EPSPS与水稻EPSPS进化关系最近。诱导蛋白表达的培养条件为1 mmol·L-1的IPTG，25℃，获得了纯度大于90%，浓度为3 mg·mL-1的重组蛋白12 mg；编号为R1711和R1712的家兔免疫后产生的多克隆抗体有较高的效价，编号为M171070、M171071、M171072的小鼠产生的单克隆抗体效价较高。进一步筛选出单抗FL-374-08能与多克隆抗体组成最佳配对抗体；酶联免疫试剂盒包被抗体的最优质量工作浓度为2 μg·mL-1，酶标抗体的最优工作浓度为10 μg·mL-1；试剂盒线性检测范围为5—80 μg·kg-1，检出限为5 μg·kg-1。抗性牛筋草植株叶片中的表达量是敏感植株的52.9倍，而茎中的表达量是敏感植株的63.0倍。在抗性牛筋草叶片中相对拷贝数是敏感植株的53.5倍，而茎中的相对拷贝数是敏感植株的78.6倍。Western blot结果表明单抗与牛筋草EPSPS有特异性免疫，并能准确区分不同敏感性植株及不同组织的蛋白含量差异。酶联免疫检测结果发现抗性牛筋草茎中的EPSPS浓度可以达到6.0 μg·L-1，而敏感植株叶片和茎中EPSPS蛋白的浓度分别为0.22和0.43 μg·L-1。获得的牛筋草EPSPS单克隆抗体特异性强、灵敏度高，研发的EPSPS酶联免疫试剂盒能够快速、准确检测牛筋草EPSPS蛋白含量并鉴定牛筋草由过量表达导致的草甘膦抗药性。

牛筋草；草甘膦；抗体；抗药性；快速检测；ELISA

0 引言

【研究意义】牛筋草（）为禾本科穇属一年生杂草，是全球“十大”恶性杂草之一[1]。牛筋草具有很强的适应力和繁殖能力，多生于农田、果园和路旁，分布于全世界温带和热带地区，在我国主要分布于黄河流域及以南的广泛区域[2-3]。草甘膦（glyphosate）是一种非选择性除草剂，具有高效、低毒、低残留等特点，常用于非耕地及部分作物田的保护性喷雾。草甘膦在我国有近50年的应用历史，长期应用使得牛筋草对其抗性问题日益突出，特别是在我国广东、广西地区的果园、菜园等作物田，此外，我国的直播稻田、棉田、茶园等也发现抗草甘膦的牛筋草种群[4]。抗草甘膦牛筋草的产生增加了防控成本，降低了作物产量和品质。研究抗性牛筋草快速、简易的检测方法，在生长初期合理选药，是有效防控牛筋草的重要技术手段。【前人研究进展】植物莽草酸途径的重要酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）是草甘膦的作用靶标。草甘膦与该酶的催化底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）结构相似，可抑制EPSPS的活性，阻断莽草酸途径，干扰芳香族氨基酸的合成，最终导致植物死亡[5]。杂草对草甘膦的抗性分为靶标抗性和非靶标抗性。靶标抗性通常是指靶标基因的突变或靶标蛋白的过量合成，导致杂草对除草剂的敏感性下降。非靶标抗性是指杂草体内对除草剂的吸收传导或代谢方式发生改变，使除草剂不能正常发挥作用[6-7]。抗性的分子检测方法主要针对靶标抗性机制，包括序列保守位点PCR检测、表达量qPCR检测、EPSPS蛋白免疫印迹检测等，以上方法对场地、仪器、技术人员的要求较高，样本处理复杂，成本较高。酶联免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）利用抗原、抗体特异性结合原理，快速对检测样品定性、定量。由于该方法的简便、快速和稳定等优点，现已应用于不同类型蛋白的检测[8-12]。【本研究切入点】目前，抗草甘膦杂草检测方法主要依赖整株植株测定法、PCR及qPCR等分子检测方法[13]，这些方法或需要较长时间，或操作难度高费用昂贵，很难应用于基层快速检测。的过量表达是牛筋草对草甘膦产生抗性的常见靶标抗性机制[14]，利用ELISA定量检测蛋白含量可快速、简便鉴定牛筋草对草甘膦的抗性。【拟解决的关键问题】通过制备牛筋草EPSPS蛋白的单克隆、多克隆抗体，利用Western blot和ELISA方法对靶标蛋白定性、定量分析，检测不同抗性水平牛筋草、不同组织的靶标蛋白含量，建立一种快速对牛筋草EPSPS蛋白定性、定量的方法，为鉴别抗草甘膦牛筋草提供有力工具。

1 材料与方法

试验于2021年5月至2022年6月在中国农业科学院植物保护研究所完成。

1.1 材料

供试种子：抗性种群采自四川省成都市双流县，敏感种群采自抗性种群附近未施用过草甘膦的荒地。

供试试剂：BL21（DE3）感受态（北京博迈德基因技术有限公司），骨髓瘤细胞（实验室保存），Ni树脂（生工生物工程（上海）股份有限公司），蛋白定量检测试剂盒（天根生化科技有限公司），小牛血清及胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM培养基（北京索莱宝科技有限公司），其余试剂均为国产分析纯。

1.2 EPSPS序列的克隆及生物信息学分析

根据前期实验室对牛筋草转录组测序的结果，设计引物克隆。从NCBI网站（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/）搜索并下载不同植物EPSPS蛋白序列。利用软件MEGA7.0.14进行多序列对比，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建进化树，并1 000次重复构建[15]。

1.3 EPSPS原核表达及纯化

根据牛筋草EPSPS蛋白序列，优化密码子合成核苷酸序列（生工生物工程（上海）股份有限公司）并构建pET30a表达载体。转化宿主菌BL21（DE3）后涂板培养，挑取pET30a-EPSPS单克隆菌落接入LB液体培养基（卡那霉素浓度50 μg·mL-1），37℃培养至OD=0.4—0.6，加入浓度为1 mmol·L-1的IPTG，25℃诱导表达6 h后，离心收集菌体；加入破碎液进行超声波裂解，收集上清和沉淀；收集的上清利用高亲和性Ni树脂进行纯化，收集流穿液、洗脱液。SDS-PAGE检测纯化效果。

1.4 EPSPS多克隆抗体的制备

1.4.1 免疫原制备将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，免疫2只新西兰大白兔，皮下免疫3次，间隔4周。

1.4.2 多克隆抗体纯化兔血清室温离心15 min，取上清，4℃搅拌缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌、离心弃上清；将沉淀溶于适量PBS（0.01 mol·L-1，pH 7.4），4℃搅拌缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌、离心，弃上清；将沉淀溶于适量PBS，4℃透析过夜，-20℃冻存备用。使用Protein A小柱进行纯化，先用超纯水过柱，再用PB缓冲液（0.4 mol·L-1，pH 7.0）平衡纯化小柱；使用甘氨酸-盐酸缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 3.0）洗脱结合位点上的抗体，并加入1 mol·L-1Tris-HCl，调节pH以保存抗体。

1.4.3 间接ELISA检测用碳酸盐缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 9.6）稀释纯化的蛋白至1 μg·mL-1，加入96孔酶标板（100 μL/孔），37℃反应3 h或4℃静置过夜；甩去液体，加入250 μL洗涤液，静置30 s，重复3次；加入检测样本（100 μL/孔），同时设置阳性对照（免疫后兔血清）、阴性对照（免疫前兔血清）和空白对照（不加兔血清），37℃反应45 min；洗涤、静置、晾干重复3次；加入HRP标记的羊抗兔酶标二抗（100 μL/孔），37℃孵育45 min；洗涤、静置、晾干重复3次；加入显色剂（100 μL/孔），室温避光孵育15 min；加入终止液（100 μL/孔），使用酶标仪在波长450 nm下读取OD值。

1.5 EPSPS单克隆抗体的制备

1.5.1 制备小鼠脾脏细胞、细胞融合及扩大培养将纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，间隔4周。加强免疫后牺牲小鼠，70%乙醇浸泡消毒，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞。在PEG4000的作用下，将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，3 d后改用HT培养液培养。10 d后，检测细胞培养上清；使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化并检测，将阳性克隆继续克隆化，直到得到的克隆均为阳性，建立阳性细胞株。最终获得5株阳性细胞株，将其扩大培养并进行冻存。

1.5.2 制备腹水提前一周在Balb/c小鼠腹腔内注射矿物油，将1×105个杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，10 d后收集腹水，离心，上清即为单克隆抗体腹水。

1.5.3 单克隆抗体纯化腹水室温离心15 min，取上清，4℃搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵至半饱和，搅拌、离心（13 000 r/min，4℃），弃上清；沉淀溶于适量PBS（0.01 mol·L-1，pH 7.4），4℃下搅拌逐滴加入饱和硫酸铵至33%，搅拌、离心30 min，弃上清；将沉淀溶于适量PBS，4℃透析过夜后，-20℃冻存备用。采用Protein G小柱进行纯化，先用超纯水过柱，再用PB缓冲液（0.4 mol·L-1，pH 7.0）平衡纯化小柱，使用甘氨酸-盐酸缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入1 mol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）中和甘氨酸，使pH保持抗体保存的中性条件。

1.5.4 抗体筛选采用间接ELISA方法对纯化后的抗体进行效价检测；用小鼠对抗体进行亚型检测；利用双抗夹心ELISA方法对制备的抗体进行筛选，筛选出可配对的抗体对，具体方法：用CB（0.1 mol·L-1碳酸盐缓冲液，pH 9.6）稀释包被抗体至10 μg·mL-1，每孔100 μL，37℃包被3 h。洗板，拍干，加入阳性标品/阴性对照/阳性样本/阴性样本，25℃下反应45 min。洗板，拍干，加入酶标抗体，每孔100 μL，25℃反应45 min，洗板，拍干，加入显色剂，25℃避光反应15 min。加入100 μL终止液，读取OD值。

1.6 ELISA试剂盒的研发

1.6.1 缓冲液的配制包被缓冲液CB（0.1 mol·L-1碳酸盐缓冲液，pH 9.6）；样品提取液PBS（0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液，pH 7.4）；洗涤液（含0.2%吐温-20的PBS）；封液闭（含1% BSA的CB）；终止液（2 mol·L-1H2SO4）。

1.6.2 酶标板的制备取一定量EPSPS单克隆抗体于包被液中，配置浓度约为2 μg·mL-1的包被工作液。将包被工作液（100 μL/孔）加入酶标板微孔，4℃静置过夜；在CB缓冲液中加入一定量的BSA、水杨酸钠和蔗糖，使BSA、水杨酸钠、蔗糖的浓度分别为1%、0.05%、5%，配置成封闭工作液；酶标板用洗板机吸干-洗涤两次；将封闭工作液按每孔150 μL加入微孔，37℃烘焙3 h。洗板、拍干，将酶标板放入冷冻真空干燥机抽干3 h，真空热封。

1.6.3 EPSPS标准品冻干粉的制备大肠杆菌（）中原核表达并通过亲和纯化的EPSPS重组蛋白（C端带有6个His标签），母液浓度为3 mg·mL-1，稀释到16 ng·mL-1。棕色玻璃瓶加入100 µL的16 ng·mL-1标准品，冷冻干燥机过夜抽干得到标准品冻干粉。

1.6.4 酶标记抗体工作液的配置取纯化的EPSPS多克隆抗体，与辣根过氧化物酶（HRP）偶联为酶标记抗体，取一定量的酶标记抗体加入样品提取液中，充分混匀，使其终浓度为2 µg·mL-1，2—8℃避光保存。HRP标记的EPSPS多克隆抗体的具体制备方法：将HRP溶于纯水，加入高碘酸钠，室温反应30 min；将等量抗体用偶联缓冲液透析过夜；HRP加入抗体溶液中，室温反应2 h，加入硼氢化钠封闭反应位点，磷酸盐缓冲液透析过夜，加入等量甘油保存于-20℃。

1.7 抗草甘膦牛筋草EPSPS表达、拷贝数及蛋白含量检测

1.7.1 qPCR检测牛筋草表达量及拷贝数选取敏感与抗性的牛筋草植株作为试验样品，取新鲜叶片、茎在液氮下研磨充分，分别提取组织的DNA、RNA并反转录，使用作为内参基因，选用专用的引物对（表1），采用qPCR的方法读取不同植株、不同组织的Ct值，处理数据得到的相对表达量和拷贝数。数据处理采用2-ΔΔCt法[16]。Ct=-[(Ct,-Ct,)处理- (Ct,-Ct,)对照][17]。

表1 本研究所用引物序列

1.7.2 Western blot检测牛筋草EPSPS表达量提取抗性与敏感植株不同组织的总蛋白，将纯化的EPSPS蛋白与Loading buffer充分混匀、煮沸，进入SDS-PAGE，以制备的单克隆抗体为一抗，采用Western blot检测目的蛋白与单抗、多抗的免疫特异性。

1.7.3 酶联免疫试剂盒检测EPSPS含量用2 mL样品提取液溶解EPSPS标准品，此溶液浓度为32 μg·L-1，梯度稀释EPSPS标准品，制成16、8、4、2、1 μg·L-1标准溶液；取0.1 g液氮研磨的牛筋草叶片、茎秆样本，加入1 mL样品提取液，振荡混匀离心取上清；将100 µL空白对照/标准品/待测样品对应的上清加入微孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45 min；将孔内液体甩干、洗涤、拍干，重复3次；加入抗体工作液（100 µL/孔），轻轻振荡混匀，25℃避光孵育30 min；加入酶标抗体（100 µL/孔），振荡混匀，25℃避光反应45 min；加入显色剂（100 µL/孔），置于25℃避光反应15 min；加入终止液（100 µL/孔），轻轻振荡混匀；酶标仪设定至450 nm，测定每孔OD值。利用统计学绘图软件，根据所测定的标准品的OD值绘制标准曲线；通过标准曲线和检测样品的OD值即可计算出未知样品中EPSPS的浓度。

2 结果

2.1 EPSPS序列的克隆与进化树分析

利用前期转录组的数据设计引物克隆，序列分析结果表明，牛筋草的开放阅读框含有1 620 bp的核苷酸，编码540个氨基酸，理论等电点为8.80，该蛋白无跨膜区域（图1）。利用MEGA7.0.14软件比对10种EPSPS蛋白序列，NJ法构建系统进化树。进化树分析表明，牛筋草EPSPS蛋白与水稻EPSPS亲缘关系最近（图2）。

2.2 EPSPS原核表达及蛋白纯化

将构建的pET30a-EPSPS阳性质粒转化宿主菌BL21，摇菌培养后，在一定条件下进行蛋白表达诱导。SDS-PAGE检测结果（图3）显示，有明显的目的蛋白产生且主要以可溶形式存在，经检测，最终目的蛋白纯度大于90%，浓度3 mg·mL-1，蛋白量12 mg。这表明，含有阳性质粒的宿主菌BL21在IPTG浓度1 mmol·L-1，温度25℃的条件下诱导6 h，可以有效表达目的蛋白。同时，在Ni树脂纯化蛋白过程中，结果显示使用200 mmol·L-1咪唑洗脱时蛋白纯度最佳。

2.3 多克隆抗体的纯化及效价检测

以纯化EPSPS蛋白为抗原，制备的多克隆抗体（检测样本）为一抗，同时，设置阳性对照、阴性对照和空白对照，加入HRP标记的羊抗酶标二抗，对多克隆抗体进行效价检测。由表2可见，编号为R1711和R1712的家兔免疫后产生的多克隆抗体有较高的效价，可用于下一步试验。

2.4 EPSPS单克隆抗体的制备

免疫4周后，对4只小鼠产生的抗体间接ELISA检测，由表3可见，编号M171070、M171071、M171072的小鼠产生的单克隆抗体效价较高，为1﹕243K。将取得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选后得到5株阳性克隆株。将细胞注入小鼠腹腔内表达抗体，收集腹水，经纯化、洗脱，采用双抗夹心ELISA方法对纯化后的单克隆抗体（FL-374-01—35）进行效价检测，由表4可知，大部分纯化后的单克隆抗体效价均＞1﹕1 024K。以多克隆抗体为酶标抗体，加入重组蛋白/阴性对照/阳性样本/阴性样本，对编号FL-374-01—35（表4）抗体进行免疫配对试验。当FL-374-08为包被抗体时，重组蛋白的OD值最高，表明此抗体与多克隆抗体的配对效果最好，因此采用FL-374-08（由保藏编号为CGMCC No.22308的杂交瘤细胞株分泌产生）与兔多抗来制备酶联免疫试剂盒。此外，用小鼠抗体亚型检测试剂盒对抗体进行亚型检测，结果均为IgG类抗体。

表2 多克隆抗体效价检测

图1 牛筋草EPSPS序列的克隆及分析

图2 牛筋草EPSPS序列的进化树分析

表3 单克隆抗体效价检测

图3 SDS-PAGE检测EPSPS蛋白的透析结果

2.5 ELISA试剂盒的组装

经验证和优化，将试剂盒检测体系建立如下：以0.1 mol·L-1、pH 9.6碳酸盐缓冲液（CB）为包被缓冲液，稀释EPSPS单克隆抗体至2 μg·mL-1，加入96孔酶标板静置过夜。使用洗涤剂（0.2%吐温-20的磷酸盐缓冲液）洗涤酶标板，CB溶液与一定量的BSA、水杨酸钠和蔗糖配置封闭工作液，每孔150 μL加入微孔，于37℃封闭3 h。以0.01 mol·L-1、pH 7.4磷酸盐缓冲液为样品提取液溶解EPSPS蛋白样品，每孔100 μL加入微孔，25℃避光孵育45 min，洗板3次；将多克隆抗体与辣根过氧化物酶（HRP）偶联，得到酶标记抗体，每孔100 μL，25℃避光孵育45 min；每孔加入100 μL显色剂，25℃避光孵育15 min；以2 mol·L-1H2SO4溶液或1 mol·L-1HCl溶液作为终止液，每孔加入100 μL，振荡终止反应（表5）。

牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体为包被抗体，浓度为1.8—2.2 μg·mL-1。制备的EPSPS多克隆抗体作为酶标记抗体，其浓度为8—12 μg·mL-1。使用样品提取液溶解EPSPS蛋白样品，制成16、8、4、2、1 μg·L-1标准溶液，经间接酶联免疫标准曲线得线性检测范围为5—80 μg·kg-1，检出限为5 μg·kg-1。

2.6 qPCR检测不同植株EPSPS表达量和拷贝数

通过qPCR检测表达量结果的比较，对研发设计的试剂盒进行敏感性和特异性评估。敏感和抗性种群每个种群中至少选取4株，提取不同组织（叶、茎）的RNA，qPCR分析靶标基因的表达量。结果发现，抗性植株的叶片中的表达量是敏感植株的52.9倍，抗性植株茎中的表达量是敏感植株的63.0倍（图4）。在抗性与敏感牛筋草植株茎中的表达量均高于叶片中。取相同植株的DNA进行相对拷贝数的检测，发现在抗性植株的叶片中相对拷贝数是敏感植株的53.5倍，在茎中是敏感植株的78.6倍（图5）。

2.7 Western blot检测不同植株EPSPS蛋白

Western blot可以实现对蛋白含量的半定量检测，用制备的牛筋草EPSPS单克隆抗体，利用蛋白免疫印迹法对抗性与敏感植株的不同组织进行蛋白表达量的检测。结果显示，本试验制备的单克隆抗体特异性强，无明显的非特异性条带。该抗体的敏感性高，能鉴定出敏感种群中EPSPS蛋白。抗性植株的叶片与茎中EPSPS蛋白的含量明显高于敏感植株的相应组织，EPSPS蛋白在敏感植株叶片中的含量略低于在茎中的含量，抗性植株叶片的EPSPS蛋白含量与茎的EPSPS蛋白含量相当（图6）。Western blot结果表明EPSPS单克隆抗体的特异性强、灵敏度高。

图4 抗性与敏感牛筋草植株不同组织的EPSPS表达量

表4 单抗与多抗的配对效果

图5 抗性与敏感牛筋草植株不同组织的EPSPS相对拷贝数

表5 ELISA试剂盒的组成

1、2：茎-敏感Stem-sensitive；3、4：茎-抗性Stem-resistant；5—7：叶-敏感Leaf-sensitive；8：叶-抗性Leaf-resistant

2.8 酶联免疫试剂盒检测不同植株EPSPS蛋白

以EPSPS标准品浓度为横坐标，标准品吸光值为纵坐标，绘制标准曲线（图7）。将样本的吸光度代入标准曲线中，读出样本对应的浓度，便于大量样本的准确、快速分析。与Western blot检测的结果类似，酶联免疫检测结果发现EPSPS蛋白在抗性牛筋草叶片与茎中的含量显著高于敏感植株，在茎中的浓度可以达到6.0 μg·L-1，而敏感植株叶片和茎中EPSPS蛋白的浓度分别为0.22和0.43 μg·L-1（图8）。使用研发的试剂盒和方法能够鉴定牛筋草样品对草甘膦是否产生抗性。

图7 EPSPS酶联免疫试剂盒标准曲线的制作

图8 酶联免疫试剂盒检测抗性与敏感牛筋草植株不同组织的EPSPS蛋白浓度

3 讨论

3.1 EPSPS的克隆与分析

莽草酸途径是微生物和植物体内的重要生物代谢途径，EPSPS是植物莽草酸途径的关键酶，也是草甘膦的靶标酶，在芳香族氨基酸合成过程中起着重要作用。草甘膦与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的结构相似，可与EPSPS竞争性结合，阻断EPSP的合成，干扰植物生理生化反应[18]。为方便研究杂草对草甘膦的抗性机制，为草甘膦抗性提供后备基因资源，目前，已在多种杂草和作物中被克隆和分析[19-20]。本研究发现牛筋草全长基因共3 106 bp，经序列比对与水稻亲缘关系最近，EPSPS蛋白全长562个氨基酸，等电点为8.80。

3.2 酶联免疫试剂盒的相关参数

构建原核表达载体对目的蛋白进行异源表达是制备单克隆抗体抗原的常用方法，但诱导条件不尽相同[21-22]。本研究通过将转化大肠杆菌获得表达纯化蛋白，诱导条件为IPTG浓度1 mmol·L-1，温度25℃下诱导6 h。本研究采用间接酶联免疫方法，以单抗为包被酶标抗体、HRP标记的多抗为酶标抗体，特异性地对蛋白进行定量分析。为确保单抗和多抗的质量，在制备过程中以绝对纯化的EPSPS蛋白为免疫原，并对纯化前后的抗体进行效价检测。Western blot结果条带单一清晰，可验证制备的多抗和单抗与纯化后的EPSPS蛋白具有特异性。在单克隆抗体筛选过程中，以纯化的单抗为包被酶标抗体，使用HRP标记高质量多克隆抗体以此作为酶标二抗，采用双抗夹心酶联免疫方法，筛选出匹配程度较高的单抗、多抗组合作为试剂盒的关键试剂。经过浓度条件的优化和标准样品的测定，确定了试剂盒所需试剂的具体浓度及样品的线性检测范围。

3.3 酶联免疫试剂盒的应用分析

本研究发现，抗性与敏感牛筋草植株叶片中的表达量要低于茎中，这与田旋花及黄瓜上检测到的的表达结果不同，这两种植物的表达量均为叶片中显著高于茎中[23-24]。有研究证实，的过量表达与该基因在染色体上的拷贝数增加相关，也可能与该基因的启动子序列发生缺失有关[25-26]。在本试验中，抗草甘膦牛筋草的抗性机制是过量表达，引起EPSPS蛋白大量积累。经该试剂盒对EPSPS蛋白的含量测定可准确辨别由过量表达引起的抗性杂草。现有研究表明，在同一牛筋草种群中基因突变（P106S、P106A）和过量表达共同导致了牛筋草抗性的产生[14,27]。只存在基因突变这一种抗性机制的牛筋草，其相对表达量和拷贝数与敏感型牛筋草情况基本一致。该试剂盒不能够检测基因突变引起的草甘膦抗性，更不能明确牛筋草的抗性水平。在本试验中，未对两种抗性机制共同作用的牛筋草进行试剂盒检验，适用性还需进一步试验。

在杂草生长初期快速鉴定除草剂抗性，可以根据检测结果制定经济有效的除草策略[28-30]。杂草抗药性检测作为抗性治理的重要环节，检测方法也在不断地深入研究和完善。现有整株水平测定法、器官或组织生物测定法、细胞或细胞器水平检测方法、生理生化鉴定法、分子水平检测法等重要的检测方法。整株水平测定法是应用最广泛的检测方法，该方法简单易行、准确性高，但时间周期长。其余几种可根据杂草的实际情况具体选择，或结合几种方法同时使用，提高准确性。分子水平的ELISA法在杂草抗性检测中不常使用，主要因为杂草抗药性关键酶的确定及其单抗的制备[31]。抗草甘膦杂草的检测方法除了整株生物测定法，还有莽草酸含量检测法、EPSPS检测法、叶绿素含量法和叶绿素荧光参数法、DNA分析法及RT-qPCR法。此次研发的试剂盒运用ELISA方法制备EPSPS的专一性单克隆抗体，可快速、灵敏、简便地检测杂草的草甘膦抗性。对仪器要求简单、操作方便的检测方法在农业生产一线更具有应用价值[32]。该试剂盒也具有一定的局限性，只能够检测由于靶标基因过量表达引起的草甘膦抗性，由于不同杂草的基因序列相似度较高，该试剂盒有检测不同杂草的潜在价值。

4 结论

获得的牛筋草EPSPS蛋白的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、效价高的优点，研发的酶联免疫试剂盒可精准定量检测牛筋草植株中EPSPS蛋白的含量，为抗草甘膦牛筋草的快速鉴定提供了有力工具。

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Development and application of ELISA kit for detection of EPSPS in

LI Zhiling, LI Xiangju, CUI Hailan, YU Haiyan, CHEN Jingchao

State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

The objective of this study is to clone the target geneof glyphosate in, obtain the recombinant protein and antibody against EPSPS protein, then assemble the EPSPS ELSIA kit, finally, to detect theexpression and protein content of different plants and tissues of, and to provide a powerful tool for rapid identification of glyphosate resistantindividuals.The full-length ofwas cloned by PCR method. The constructed pET30a-EPSPS positive plasmid was transformed into host bacteria BL21, which was induced by IPTG to express and purify the protein. Monoclonal and polyclonal antibodies were prepared by immunizing mice and New Zealand white rabbits with EPSPS recombinant protein as immunogen, and the specificity of the antibodies was detected by Western blot. Best matching antibody was screened by indirect ELISA. the working concentration of each reagent was optimized and the kit was assembled. The content of EPSPS in differentpopulations was detected by the assembled kit and compared with the results of qPCR.The open reading frame ofcontains 1 620 bp nucleotide and encodes 540 amino acids, with a theoretical isoelectric point of 8.80. The protein has no transmembrane region. The evolutionary tree analysis showed that the evolutionary relationship between EPSPS ofand EPSPS of rice was the closet. The protein could be expressed under a condition of 1 mmol·L-1IPTG, 25℃. After purification, the purity of prokaryotic expression protein was more than 90%, the concentration was 3 mg·mL-1, and the protein content was 12 mg. Polyclonal antibodies produced from rabbits numbered R1711 and R1712 showed higher potency. Monoclonal antibodies produced from mice numbered M171070, M171071 and M171072 showed higher potency. A group of optimal matching antibodies (FL-374-08 monoclonal antibody and polyclonal antibody) were screened. The optimal concentration of coated antibody was 2 μg·mL-1. The optimal concentration of enzyme-labeled antibody was 10 μg·mL-1. The linear detection range of Elisa kit was 5-80 μg·kg-1, and the detection limit was 5 μg·kg-1. The expression ofin leaf of resistant individuals was 52.9 times higher than that in the susceptible individuals. Similarly, it was 63.0 times higher in stem. In the resistance individuals, the relative copy number ofin leaf was 53.5 times higher than that in the susceptible individuals, and it was 78.6 times higher in stem. Western blot results showed that monoclonal antibodies had specific immunity to EPSPS and could accurately distinguish the difference of protein content in different plants and tissues. The concentration of EPSPS in stem of resistant individuals was 6.0 μg·L-1, while, it was only 0.22-0.43 μg·L-1in susceptible individuals, which detected by Elisa kit.The monoclonal antibody of EPSPS obtained in this study showed higher specificity, and sensitivity. The Elisa kit can be used to quickly and accurately identify glyphosate resistance inwhich caused byoverexpression.

; glyphosate; antibody; resistance; rapid detection; ELISA