LYRM2表达通过调控糖酵解代谢影响结肠癌RKO细胞增殖、侵袭

黄 琦，吴婧婧，彭 瑶，李 娜，王年飞

结直肠癌是胃肠道常见的肿瘤之一。近年，全球结直肠癌发病率、病死率显著提升。2020年全球结直肠癌总发病率上升至第3位，病死率上升至全球癌症死亡原因的第2位[1]。因此，发现新的介导结直肠癌恶性转化的调控分子有望为控制结直肠癌的发展提供靶点，对提高结直肠癌患者的生存具有重要的临床价值，也是亟待解决的问题。有研究显示，肿瘤代谢过程的干预是实现肿瘤防治的新手段，具有较好的抑制效果[2-3]。本组前期实验发现，在结直肠癌中高表达的LYRM2分子可通过Akt-LYRM2-Comlplex Ⅰ代谢轴在结直肠癌细胞氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)代谢中发挥重要作用[4]。因此，本文着重探讨LYRM2对结肠癌糖酵解代谢的调控机制，为LYRM2作为结肠癌的潜在治疗靶点提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂人结肠癌细胞系RKO购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，培养于含10%FBS的RPMI 1640完全培养基中。LYRM2过表达载体L2HA(对照为CHA载体)和LYRM2干扰载体SH1KD(对照为GPH载体)及相应的慢病毒颗粒购自上海英为信公司(因LYRM2抗体效果不佳，构建L2HA、CHA载体中加入HA标签便于蛋白水平验证转染成功，CHA为带有HA标签的对照空载体，GPH为对照空载体)；RPMI 1640培养基、胎牛血清等购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自上海李记公司；Transwell试剂盒购自北京康宁公司；Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒购自美国Agilent公司；细胞乳酸含量检测试剂盒、代谢酶活性检测试剂盒，均购自北京索莱宝公司。

1.2 肿瘤细胞慢病毒转染转染前24 h，将对数生长期的RKO细胞以2×105个/孔铺至24孔板中，细胞汇合度约50%。按病毒转染试剂盒说明书进行操作。SH1KD ShRNA序列：5′-TGATGATTACT CAAGGCAATA-3′。

1.3 CCK-8实验检测细胞增殖按2 000个/孔的细胞量重复接种至6块96孔板中，更换10 μL CCK-8+100 μL新鲜培养基的混合液(避免产生气泡)，680型酶标仪检测450 nm处的吸光值。每24 h检测1块96孔板，连续检测6天。

1.4 细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力划痕实验：将5×106个/孔细胞接种至6孔板中，待汇合度达80%～90%时，移除培养基，超净台中用200 μL的移液枪头划3条直线，分别于0 h和培养48 h后拍照。Transwell实验：基质胶和无血清培养基按1 ∶5稀释、混匀(冰浴上操作)，取100 μL于上室，37 ℃孵育4～5 h至凝固。取100 μL密度为1×104/mL重悬于无血清培养基的细胞铺于上室，下室加入含15%FBS的培养基，37 ℃孵育24 h。经10%中性福尔马林固定，0.1%结晶紫染色15 min，PBS冲洗2次，棉棒轻柔擦除小室上表面细胞。显微镜观察小室下层穿过的细胞数，随机计数5个视野。

1.5 海马(Seahorse)细胞能量检测按(1.0～1.5)×104个/孔细胞种植于海马细胞培养板，每孔约80 μL，于培养基中培养过夜。每孔加入200 μL校正液到Sensor Cartridge中，于无CO2的37 ℃培养箱中水化过夜。更换培养基，加入基础测试液润洗细胞3次，最终维持每孔175 μL，于无CO2的37 ℃培养箱中培养1 h。配制检测过程中需加入的药物：10 mmol/L 葡萄糖、1 μmol/L寡霉素、50 mmol/L 2-DG。将矫正后的Cartridge板每个加药孔中加入相应药物25 μL。机器中矫正平衡30 min后运行检测。完成后计数各孔细胞，标准化最终检测结果，得到各组细胞糖酵解代谢水平。进一步基于Wave软件转化、计算得出各组细胞ATP含量(单位定义为每分钟104个细胞产生的ATP含量)。

1.6 细胞乳酸含量检测按试剂盒说明书溶解、配制各试剂。按50×104个细胞：1 mL提取液混匀细胞，冰浴超声波破碎细胞，4 ℃、12 000g离心10 min后取上清。按试剂盒说明书顺序加样各试剂后，于分光光度计检测、计算细胞乳酸含量，具体溶剂配制，计算公式参考说明书，单位定义为104个细胞的产生乳酸量。

1.7 细胞代谢酶活性检测HK2、PK、PHK、LDH按试剂盒说明书溶解、配制各试剂。收集细胞至离心管中，按50×104细胞：1 mL提取液混匀细胞，冰浴超声波破碎细胞，4 ℃、8 000g离心10 min后取上清。按说明书顺序加样各试剂后于分光光度计检测、计算各代谢酶活性。具体溶剂配制、计算公式参考试剂盒说明书。单位U定义：每1×104个细胞每分钟生成1 nmoL NADPH定义为1个酶活力单位。

2 结果

2.1 LYRM2过表达、敲低结肠癌细胞系的构建及验证利用LYRM2过表达载体L2HA和干扰载体SH1KD构建稳转LYRM2过表达及敲低结肠癌细胞系。mRNA表达验证：转染L2HA的RKO细胞LYRM2的mRNA表达(167.10±3.73)显著高于对照CHA细胞(8.79±0.17)，差异有统计学意义(P<0.001)；转染SH1KD的RKO细胞LYRM2的mRNA表达(1.13±0.11)显著低于对照GPH细胞(11.51±0.82)，敲低率达90%，差异有统计学意义(P<0.01，图1A)。利用HA标签抗体进行Western blot实验，结果证实LYRM2蛋白在RKO细胞中成功转染，稳定表达(图1B)。

图1 LYRM2过表达及敲低细胞系mRNA及蛋白水平验证：A. mRNA表达；B.蛋白表达；***P<0.001

2.2 LYRM2差异表达对RKO细胞增殖的影响CCK-8实验显示：LYRM2过表达L2HA细胞的增殖比对照CHA细胞显著加快，尤其在第6天，LYRM2过表达L2HA细胞的吸光度是对照CHA细胞的1.53倍[OD450 nm：(1.83±0.08)vs(1.20±0.09)，P<0.001]；第6天LYRM2敲低SH1KD细胞的增殖速率比对照GPH细胞显著降低[OD450 nm：(0.82±0.07)vs(1.35±0.09)，P<0.01，图2]。

图2 LYRM2差异表达对RKO细胞增殖的影响：***P<0.001

2.3 LYRM2差异表达对RKO细胞迁移能力的影响细胞划痕实验显示：LYRM2过表达L2HA细胞随时间延长迁移速度显著高于对照CHA细胞，在48 h迁移距离分别为(46.67±0.33) μm和(28.33±0.33) μm；LYRM2敲低的SH1KD细胞在48 h迁移距离仅约(3.67±0.33) μm，显著低于对照GPH细胞(27.67±0.33) μm，差异有统计学意义(P<0.001，图3)。

图3 LYRM2差异表达对RKO细胞迁移能力的影响

2.4 LYRM2差异表达对RKO细胞侵袭能力的影响Transwell实验显示：LYRM2过表达的L2HA细胞侵袭数目(941.70±39.55)比对照CHA细胞(469.30±21.53)明显增多；LYRM2敲低的SH1KD细胞侵袭数目(87.00±9.29)比对照GPH细胞(504.30±3.48)明显减少，差异均有统计学意义(P<0.001，图4)。

图4 LYRM2差异表达对RKO细胞侵袭能力的影响

2.5 LYRM2差异表达对RKO细胞糖酵解代谢的影响Seahorse实验检测不同LYRM2表达RKO细胞的糖酵解代谢水平；通过细胞外酸化率(extra-cellular acidification rate,ECAR)检测细胞的胞外产酸能力，间接显示糖酵解能力。在不同时间点分别加入高浓度葡萄糖、寡霉素(ATP合酶抑制剂)和2-DG(糖酵解抑制剂)检测在不含葡萄糖或丙酮酸的糖酵解压力测试培养基中培养细胞的糖酵解水平。结果显示：LYRM2过表达的L2HA细胞糖酵解代谢水平显著高于对照CHA细胞，LYRM2敲低SH1KD细胞糖酵解水平明显低于对照GPH细胞，差异有统计学意义(P<0.001，图5)。计算细胞ATP含量与细胞糖酵解结果一致，表现为LYRM2过表达L2HA细胞ATP含量高(5.68±0.39) pmoL，LYRM2敲低SH1KD细胞ATP含量低(1.71±0.09) pmoL，分别与对照CHA、GPH细胞相比，差异均具有统计学意义(P<0.001)。各组细胞内乳酸生成量：LYRM2过表达L2HA细胞内乳酸含量(66.70±0.87) nmoL比对照CHA细胞(10.08±0.12) nmoL明显增加(P<0.001)，LYRM2敲低SH1KD细胞内乳酸含量(6.02±0.10) nmoL比对照GPH细胞(9.65±0.20) nmoL明显减少(P<0.01，图6)。

2.6 LYRM2差异表达对RKO细胞代谢酶活性的影响肿瘤组织糖酵解关键代谢酶包括HK、PFK异构体和PK。检测不同LYRM2表达的RKO细胞内各糖酵解关键代谢酶活性：LYRM2高表达L2HA细胞内HK2活性为(0.126±0.002) U，显著高于对照CHA细胞HK2活性(0.098±0.002) U；LYRM2低表达SH1KD细胞内HK2活性为(0.076±0.002) U，显著低于对照GPH细胞HK2活性(0.099±0.002) U，差异均有统计学意义(P<0.001)。各LYRM2差异表达的RKO细胞中，PFK和PK酶活性差异无统计学意义(图7)。

图5 LYRM2对RKO细胞糖酵解代谢的影响：ECAR.细胞外酸化率

图6 LYRM2表达对RKO细胞内ATP及乳酸生成的影响：A. ATP；B.乳酸；**P<0.01，***P<0.001

3 讨论

LYRM2位于6号染色体，编码约10.4×103大小的蛋白质。目前，有关LYRM2的研究有限。本组前期实验发现LYRM2蛋白主要定位于线粒体，在结直肠癌中可通过与Complex Ⅰ结合参与Complex Ⅰ活性的调控，对结直肠癌细胞OXPHOS代谢有显著调节作用[4]。

肿瘤细胞为维持不受控的迅速增殖，需要大量的能量及营养物质。糖酵解因其产能速率明显快于线粒体OXPHOS而被肿瘤细胞主要利用。当肿瘤细胞的糖酵解代谢被抑制时，OXPHOS会代偿性增加以维持肿瘤细胞的存活及增殖，这种肿瘤细胞适应性的调整其代谢途径的行为称为肿瘤细胞的可塑性[5-6]。在氧气充足的条件下，肿瘤细胞依赖有氧糖酵解和OXPHOS双重代谢供能，不同肿瘤细胞的差异在于糖酵解和OXPHOS产能比例不同，一些肿瘤细胞中OXPHOS产能普遍超过40%，在某些特殊细胞中如MCF-7，这一比例可高达80%[7]。越来越多的证据表明，代谢的改变与肿瘤的恶性转化密切相关[8]。目前，肿瘤的特征在经历Hanahan等[9]的三代更新后，“细胞能量代谢的异常调控”仍作为肿瘤的十四大特征之一，其始终作为肿瘤进展中的核心问题。研究提示肿瘤代谢过程的干预是实现肿瘤治疗新的手段之一，如果能够同时性阻断肿瘤细胞糖酵解代谢和OXPHOS代谢可能成为治疗肿瘤的新策略。本组前期实验已证实，LYRM2对结直肠癌细胞的OXPHOS代谢具有重要的调控作用；本组发现LYRM2表达对结肠癌RKO细胞糖酵解代谢也具有显著影响：LYRM2高表达促进RKO细胞糖酵解代谢，LYRM2低表达抑制RKO细胞糖酵解代谢。对糖酵解代谢过程限速酶活性分析发现：LYRM2高表达增强RKO细胞内HK2活性，LYRM2低表达抑制RKO细胞内HK2活性。由此，作者推测LYRM2可能通过调控结肠癌RKO细胞糖酵解过程限速酶HK2的活性参与糖酵解代谢调节，进一步影响RKO细胞的增殖、迁移及侵袭表型。

基于LYRM2定位于线粒体，参与线粒体Complex Ⅰ活性调节，作者查阅文献发现，Complex Ⅰ对于诱导糖酵解，维持细胞的增殖存活至关重要[10-13]。功能正常的Complex Ⅰ可以诱导缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)表达，继而激活细胞糖酵解，并激活相关致瘤通路。当Complex Ⅰ功能失调，线粒体内多种参与三羧酸循环的关键酶包括α-酮戊二酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶复合体等受到影响，线粒体内α-酮戊二酸的累积促使HIF-1α的降解，即使在无氧条件下也不能诱导糖酵解的发生[10-11]。这可能是LYRM2表达诱导糖酵解代谢改变的间接机制。本组通过酶活实验证实，LYRM2表达对糖酵解代谢限速酶HK2的活性产生影响，这可能是LYRM2诱发糖酵解代谢改变的直接通路，但需进一步探索及验证。

图7 LYRM2表达对RKO细胞内代谢酶活性的调节：A.HK2；B.PFK；C.PK；***P<0.001，ns.差异无统计学意义

研究显示结直肠癌中HK2蛋白水平上调，与肿瘤大小、侵犯深度、肝脏转移及肿瘤分期等显著相关，且HK2高表达与患者复发及总病死率增加密切相关，HK2高表达是结直肠癌患者的独立预后因素[14-15]。靶向HK2的治疗已提示具有较好的抑制结直肠癌进展的效果[16-18]。结直肠癌细胞HK2敲低后，细胞的乳酸生成量、增殖速率及迁移能力均明显下降，同时对5-氟尿嘧啶化疗敏感性增加[19]。即便如此，糖酵解调控酶活性受肿瘤微环境变化的影响，单一靶点抑制不足以抑制肿瘤增殖，多靶点联合治疗可能为更好的选择。总之，LYRM2作为同时参与调控结肠癌细胞OXPHOS和糖酵解代谢分子，可能为结肠癌的治疗提供新靶点。