KAT2A通过Survivin乙酰化抑制Wnt/β-catenin通路调控食管癌的机制

梁宗英，杨 阳，孙光蕊，郑竞雄，赵宝山，侯继申

食管癌是全球范围内男性癌症相关死亡的第六大原因，其高侵袭性及高复发率致使患者总生存质量差[1]。Survivin在凋亡抑制蛋白家族中抗凋亡能力最强，广泛表达于多种恶性肿瘤中[2]。Survivin可以通过复杂的机制调节肿瘤细胞周期和凋亡通路，促进肿瘤细胞增殖，加速肿瘤进展，从而导致患者预后不良[3]。KAT2A是GCN5相关乙酰转移酶家族(GCN5-related nacetyltrans-ferases family, GNAT)的成员，可以与乙酰辅酶A(CoA)结合并将乙酰基转移到组蛋白上，进而改变蛋白的功能[4]。文献报道KAT2A在鼻咽癌、急性髓系白血病及胃癌的癌变和进展过程中发挥关键作用[5]。然而，关于KAT2A作为乙酰基转移酶对食管癌病变中相关蛋白乙酰化修饰的潜在作用尚未见报道。因此，本文观察下调KAT2A对食管癌细胞内Survivin乙酰化及细胞功能的影响，探讨KAT2A与Survivin乙酰化的内在联系以及在食管癌增殖及迁移中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 组织和细胞收集2019年1月～2021年1月承德医学院附属医院胸外科食管鳞状细胞癌45例，用癌组织作为实验组，正常食管黏膜组织(距癌组织边缘大于8 cm)为对照组。患者均无其他肿瘤史，术前未行放、化疗。45例患者中，男性41例，女性4例；≥60岁38例，<60岁7例；TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期34例，Ⅲ期6例；分化程度：低分化7例，中分化30例，高分化8例；有淋巴结转移5例，无淋巴结转移40例。食管癌EC109细胞和正常食管黏膜上皮HEEC细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院。本实验经承德医学院附属医院伦理委员会批准通过。

1.2 材料培养基、血清、胰蛋白酶消化液、Matrigel基质胶购自上海纪宁公司。凝胶电泳试剂盒及细胞裂解液等购自上海通蔚公司。Alexa Fluor 488-conjugated羊抗兔荧光抗体、ATTO 594-conjugated羊抗鼠荧光抗体购自河北贝博公司。KAT2A、Survivin、Acetylated-Lys抗体、wnt3α、β-catenin和c-myc单克隆抗体、A/G琼脂糖珠购自Abcam公司。RNA干扰序列由上海生物工程公司设计合成。

1.3 方法

1.3.1免疫组化法 组织脱蜡、破膜、修复抗原；血清室温封闭；清洗后加入一抗；次日加二抗。采用免疫组化SP法染色，DBA显色，苏木精复染。免疫组化判断标准：根据细胞膜、胞质染色程度和阳性细胞百分率进行评分，每张切片高倍镜下随机观察10个视野。(1)根据细胞染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；(2)根据阳性细胞百分率评分：阳性细胞<10%为1分，10%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项得分相加作为最终评分：0～2分为阴性，3～7分为阳性。

1.3.2生物信息学分析和预测 生物信息学软件乙酰化集富集法软件(Acetylation Set Enrichment Based, ASEB)预测可以将Survivin蛋白作为底物催化其发生乙酰化的乙酰基转移酶[6]。ASEB不仅可以预测目的蛋白的乙酰化状态，还可以预测催化目的蛋白发生乙酰化修饰的乙酰基转移酶及可能发生乙酰化的赖氨酸位点。

1.3.3免疫荧光法 组织切片经二甲苯及乙醇脱蜡，PBS清洗后抗原修复；5%血清室温封闭；加一抗(Survivin抗体1 ∶1 000，KAT2A抗体1 ∶1 000)，4 ℃过夜，37 ℃复温45 min，PBS洗3次；加荧光标记的二抗；DAPI染色10 min，PBS洗3次；抗荧光淬灭封片剂封固，拍照。

1.3.4细胞培养、分组及转染 以转染siRNA KAT2A细胞为实验组(si-K)，转染无siRNA细胞为阴性对照组(si-N)，正常细胞为空白对照组(NC)。食管癌细胞悬液计数，接种到6孔板中，常规培养。用30 μL 1×riboFECT CP Buffer(V1)稀释1.25 μL 20 μmol/L siRNA储存液(V2)，轻轻混匀，室温孵育5 min；加入3 μL riboFECT CP Reagent(V3)，混匀后孵育；将riboFECT CP混合液加入到465.75 μL细胞培养基(V4)中，使总体积达500 μL，混匀；继续培养48 h后以荧光倒置显微镜下观察转染效果。

1.3.5RT-qPCR实验 提取RNA，反转录试剂盒反转录。荧光定量试剂盒检测mRNA的表达；PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45s，合计30个循环。溶解曲线参照仪器自动程序。

1.3.6Western blot实验 蛋白测定浓度，制备电泳蛋白上样液，行凝胶电泳。电泳后，转膜。加一抗4 ℃过夜。次日孵育二抗，重复洗膜后显影。

1.3.7免疫共沉淀实验 蛋白测定浓度，加入5 μL目的蛋白纯抗体和5 mL A/G琼脂糖珠，混匀后2×裂解缓冲液补充至总体积450 μL，离心后，取400 μL上清液置入离心管，4 ℃、15 r/min共沉淀12 h。4 ℃离心，弃上清液。1×裂解缓冲液500 μL洗涤A/G琼脂糖珠。离心3 min，弃上清液。重复洗涤3次；最后一次洗涤完毕后，弃去上清液。1×裂解缓冲液35 μL和等体积的2×SDS上样缓冲液混合，煮沸后离心；下一步行Western blot实验。

1.3.8细胞功能学实验 (1)MTT实验：细胞计数后接种于96孔板。常规培养后转染。分别于12、24、48、72 h时间点各拿出一块板，加入MTT液30 μL，继续常规孵育4 h。加入二甲基亚砜，80 r/min摇匀5～10 min，待结晶消失后用酶标仪测定570 nm处的细胞吸光度值(OD值)。(2)划痕修复实验：细胞接种于96孔板。无菌移液枪头划痕，继续培养，分别于划痕后24、48、72 h观察细胞生长状态，并在倒置显微镜下测量划痕宽度。(3)Transwell小室侵袭实验：Matrigel稀释液包滤膜，过夜聚合成胶。小室灭菌后抽去残余的胶液，培养液湿化1 h。备转染后单细胞悬液。Transwell小室放入24孔板，取出小室，室外加培养基600 μL。小室内加200 μL细胞悬液，每组细胞重复6个样本。培养48 h后取出小室，PBS淋洗，擦去微孔膜内层细胞。多聚甲醛固定后结晶紫染色。显微镜下计数穿膜细胞数。

2 结果

2.1 食管癌和正常食管黏膜组织中Survivin乙酰化水平癌组织中Survivin蛋白乙酰化率为(66.48±3.14)%，高于正常食管黏膜组织的(17.31±2.42)%，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 食管癌和正常食管黏膜组织中Survivin蛋白乙酰化水平

2.2 食管癌和正常食管黏膜组织中Survivin和KAT2A蛋白表达量免疫组化检测显示：癌组织和正常食管黏膜组织中Survivin蛋白阳性率分别为71.11%(32/45)和28.89%(13/45)，KAT2A蛋白阳性率分别为75.56%(34/45)和24.44%(11/45)，差异均有统计学意义(P<0.05，图2)。Western blot结果显示：Survivin在癌组织中表达为(74.35±3.43)%，高于正常食管黏膜组织(22.62±2.48)%；KAT2A在癌组织中表达为(70.68±3.15)%，高于正常食管黏膜组织的(23.87±2.67)%，差异均有统计学意义(P<0.05，图3)。

癌组织正常组织SurvivinKAT2A

2.3 乙酰基转移酶KAT2A以Survivin为底物催化其发生乙酰化的预测生物信息学软件ASEB预测结果显示：乙酰基转移酶KAT2A可以将Survivin作为底物催化其发生乙酰化，其可能发生乙酰化的赖氨酸(K)为121和349号位点(P<0.05，表1)。

图3 Western blot法检测食管癌及正常食管黏膜组织中Survivin和KAT2A蛋白表达

表1 乙酰基转移酶KAT2A以Survivin为底物发生乙酰化的预测

P值越小，其位点发生乙酰化的几率越大

2.4 免疫荧光检测食管癌组织中Survivin和KAT2A蛋白表达免疫荧光结果显示：Survivin和KAT2A蛋白在食管癌组织中同时呈高表达，两者主要表达于细胞质中，部分表达于细胞核中(图4)。

2.5 食管癌组织中Survivin乙酰化和KAT2A的相关性相关性分析显示：食管癌组织中Survivin乙酰化和KAT2A表达呈正相关性(r=0.326，P=0.025，表2)。

表2 食管癌组织中Survivin乙酰化与KAT2A的相关性

2.6 食管癌EC109和正常食管黏膜上皮HEEC细胞中KAT2A和Survivin乙酰化蛋白表达KAT2A在EC109细胞中阳性率为(87.36±4.24)%，高于HEEC细胞中的(17.45±2.78)%。EC109细胞内Survivin蛋白乙酰化水平为(87.79±4.12)%，高于HEEC细胞的(21.28±3.78)%(图5)。

图4 免疫荧光检测Survivin和KAT2A在食管癌组织中表达：Survivin绿色荧光，KAT2A红色荧光，DAPI细胞核染色，MERGE为三图融合图像

图5 人食管癌EC109和正常食管黏膜上皮HEEC细胞系中KAT2A表达和Survivin乙酰化水平：A.Western blot和免疫共沉淀法测定KAT2A表达和Survivin乙酰化；B.定量检测KAT2A蛋白表达；C.定量检测Survivin乙酰化蛋白表达；**P<0.01

2.7 下调KAT2A对Survivin mRNA和蛋白表达及Survivin蛋白乙酰化水平的影响合成的KAT2A-siRNA含有cy3红色荧光标签，转染EC109细胞成功后可见细胞内有红色荧光表达(图6)。qRT-PCR检测三组细胞内KAT2A mRNA和蛋白表达量结果显示：si-K组mRNA和蛋白表达量明显低于si-N组及NC组(P<0.05，图7)，说明设计合成下调KAT2A的RNA干扰序列有效。si-K组Survivin mRNA和蛋白表达量与si-N和NC组相比差异无统计学意义(P>0.05，图8)，说明RNA干扰下调KAT2A后对Survivin mRNA和蛋白表达无影响。RNA干扰下调KAT2A后，si-K组Survivin蛋白乙酰化水平显著下降，而si-N组和NC组Survivin蛋白乙酰化水平变化差异无统计学意义(P>0.05，图9)。

明视野荧光视野叠加图

图7 RNA干扰KAT2A后KAT2A mRNA和蛋白表达量变化：A. KAT2A蛋白表达量；B.KAT2A mRNA相对表达量；与si-K相比，*P<0.05

2.8 下调KAT2A对wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表达的影响Western blot结果显示：与si-N组和NC组相比，si-K组中wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表达量显著下降(P<0.05)。si-N组和NC组相比，wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表达无变化(图10)。

图8 RNA干扰KAT2A对Survivin mRNA和蛋白表达量的影响：A. Survivin蛋白表达量；B. Survivin mRNA相对表达量

图9 RNA干扰下调KAT2A对Survivin蛋白乙酰化水平的影响

图10 下调KAT2A对wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表达水平的影响

2.9 下调KAT2A对EC109细胞存活、迁移和侵袭能力的影响MTT实验结果显示：与si-N组和NC组相比，si-K组中EC109细胞的吸光度值显著降低，细胞存活能力下降(图11)。划痕愈合实验结果显示：si-K组中EC109细胞划痕愈合缓慢，迁移能力下降(图12)。Transwell小室侵袭实验结果显示：si-K组中EC109细胞穿膜数量显著减少，侵袭能力下降(图13)。

图11 下调KAT2A对食管癌EC109细胞存活能力的影响：与si-K相比，*P<0.05

图12 下调KAT2A对食管癌EC109细胞迁移能力的影响

si-Ksi-NNC

3 讨论

食管癌的发病较隐匿，部分患者发现时已发生远处转移，总体预后不佳[7]。随着现代医学对基因的深入研究，靶向治疗为食管癌患者提供了更好的选择。因此，筛查食管癌发病相关因子为临床提供诊疗靶点成为目前医学领域研究的新热点。蛋白乙酰化修饰参与多种生命活动，在调控肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭机制过程中具有十分重要的作用[8]。近年研究发现非组蛋白也可以发生乙酰化，且与肿瘤的发生发展密切相关[9]。Survivin蛋白是一种凋亡抑制基因产物，在多种肿瘤中呈高表达，并与细胞的增殖和凋亡密切相关[10-11]。本课题组前期研究表明，Survivin蛋白与食管癌TNM分期、组织分化和淋巴结转移密切相关[12]。本实验证实，Survivin蛋白在食管癌组织中呈高表达并发生乙酰化，且癌组织中乙酰化率显著高于正常组织。进一步通过免疫共沉淀证实：在食管癌组织和EC109细胞中Survivin蛋白作为一种非组蛋白发生乙酰化，其结果与课题组在食管癌组织中的研究结果一致。然而，Survivin蛋白乙酰化参与食管癌发生、发展的深入机制仍不明确。

KAT2A属于组蛋白乙酰转移酶GNAT超家族的成员之一，可以催化多种蛋白底物发生乙酰化，并参与多种癌症的发生和发展[13-14]。本实验结果证实KAT2A在癌组织中表达升高，但在食管癌中KAT2A作为乙酰基转移酶能否催化Survivin的乙酰化修饰进而调控食管癌的发生发展尚需进一步验证。进一步通过生物信息学预测结果显示，乙酰基转移酶KAT2A可以将Survivin作为底物催化其发生乙酰化，其可能发生乙酰化的赖氨酸(K)为121和349号位点。免疫荧光实验证实，Survivin和KAT2A共同表达于食管癌细胞质，且两者同时呈高表达状态，且KAT2A表达与Survivin乙酰化呈正相关；提示在食管癌中KAT2A可以与Survivin相互作用，KAT2A作为乙酰基转移酶可能参与Survivin蛋白的乙酰化修饰。

在沉默乙酰基转移酶促进相关蛋白发生去乙酰化作用机制中，下调KAT2A有可能发挥更高的去乙酰化作用。故本实验设计合成KAT2A的siRNA干扰序列并转染食管癌EC109细胞，结果显示：KAT2A基因下调后食管癌细胞内Survivin蛋白乙酰化水平降低，提示Survivin的乙酰化修饰受乙酰基转移酶KAT2A的调控，KAT2A是Survivin蛋白发生乙酰化的上游分子。细胞功能实验结果显示：下调KAT2A后，EC109细胞的存活能力下降，细胞的愈合迁移距离缩短，穿过滤膜的细胞数量明显减少，提示下调KAT2A降低Survivin乙酰化水平后，抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

上皮-间质转变在恶性肿瘤的侵袭及转移过程中具有重要作用[15]。肿瘤的上皮-间质转化与Wnt/β-catenin信号通路的异常表达密切相关[16-17]。当Wnt/β-catenin信号通路异常激活时，多种因子可与β-catenin相互作用，使β-catenin由胞质转移至核内，Wnt/β-catenin信号通路相关因子发生改变，从而诱导细胞癌变[18-19]。本组检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达结果证实：下调KAT2A可降低wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表达量，提示下调KAT2A降低Survivin乙酰化水平后，可阻止Wnt/β-catenin通路的信号传导，进而影响食管癌细胞的存活、迁移及侵袭能力。

综上，食管癌中乙酰基转移酶KAT2A与Survivin乙酰化修饰密切相关。外源性RNA干扰下调KAT2A表达能够降低Survivin乙酰化水平，并抑制Wnt/β-catenin信号传导通路，进而抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。KAT2A作为乙酰基转移酶可能是调控Survivin发生乙酰化的重要上游分子学事件，为食管癌的临床治疗提供新的分子靶点。