黑色素瘤中SIRT7和自噬相关蛋白的表达相关性及其对放疗抵抗的影响

尤 佳，孟冰瑶，梁枭婷，华婉瑜，方 春，陈 洁，周 良，周 蕊

黑色素瘤(melanoma)是来源于黑色素细胞的恶性肿瘤，具有高侵袭性和转移性，是皮肤癌死亡的主要原因[1-2]。放疗是一种重要的肿瘤治疗方式，可通过高剂量的红外能量诱导DNA损伤、脂质和蛋白质分解，促进癌细胞死亡。然而，由于黑色素瘤本身有较强的抗辐射性，目前放疗仅用于转移性黑色素瘤和某些头颈部黑色素瘤的辅助治疗[3]。因此，明确黑色素瘤放疗抵抗的机制，将为黑色素瘤的临床治疗提供有力的治疗靶点和方案。

Sirtuin家族是一组高度保守的脱乙酰基酶，人类共有7个Sirtuin成员(SIRT1～SIRT7)，可与p53、FOXO、PGC-1a、Ku70等蛋白相互作用，调节应激反应、代谢、衰老、凋亡等重要病理、生理过程，并参与DNA损伤和修复[4]。SIRT7可以通过将蛋白脱乙酰化调节细胞和表观遗传稳态，抑制细胞凋亡[5-8]。然而，SIRT7在调节黑色素瘤放疗抵抗中的作用并不清楚。本实验通过检测黑色素瘤中SIRT7和自噬相关蛋白的表达，探讨其对放疗抵抗的影响，为黑色素瘤治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物来源人黑色素瘤A375细胞，购自广州Cellcook生物公司。雄性裸鼠(BALB/C-nu/nu)，4～5周龄，体重10～15 g，购自南方医科大学动物中心，用于构建体外移植瘤动物模型。

1.2 彗星电泳实验将0.8%琼脂糖凝胶置于载玻片上形成下胶，置于4 ℃过夜；按照同样的方法配制0.9%低熔点的琼脂糖胶作为上胶；将消化下来的细胞与熔化后冷却至37 ℃的上胶混合，将细胞悬液和凝胶混合液滴在下胶上，4 ℃静置4 h；将铺好凝胶的玻片在20 V、300 mA的条件下避光电泳30 min；电泳结束后将玻片浸泡在中和液中充分中和；加入含EB的碘化丙锭(propidium iodide, PI)染料染色10 min，在荧光显微镜下观察拍照，并用Image J图像分析软件进行分析。

1.3 RNA测序及分析将不同处理的黑色素瘤细胞样本送至广州瑞宝生物公司进行转录组学测序。使用Tophat2将RNA-Seq数据比对到人类基因组上(http://ccb.jhu.edu/software/tophat)；将HTSeq(http://www-huber.embl.de/HTSeq)应用于比对的数据集，明确具有显著差异表达的基因。使用DAVID 6.8更新差异表达基因的GO分析和KEGG分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。RNA序列数据已上传GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。

1.4 Western blot提取细胞总蛋白并用Bradford法检测蛋白浓度；配制聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离蛋白质；将分离胶上的蛋白转至PVDF膜，加入3%BSA封闭液室温封闭1.5 h；按照1 ∶5 000的比例加入TBST稀释的一抗，4 ℃孵育过夜；按1 ∶5 000的比例加入TBST稀释的二抗，37 ℃孵育1.5 h；将PVDF膜条带正面朝上，平铺在X光片板上，用显色液均匀覆盖PVDF膜条带后，放入显影仪中进行曝光，并拍照保留结果。

1.5 异体移植瘤模型建立取体重无统计学差异的小鼠，将各处理的黑色素瘤细胞皮下注入小鼠的左右背部；用游标卡尺测量并记录肿瘤体积，用公式计算肿瘤体积：V=ab2/2，其中a为肿瘤最长径，b为垂直方向最大横径；当肿瘤体积达到1 500 mm3时，颈椎脱臼法处死小鼠，并取出皮下瘤。

1.6 免疫组化取石蜡切片，置于60～65 ℃恒温烤箱中30 min烤片；将石蜡组织切片置于二甲苯(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)各10 min，再依次经100%、95%、80%、75%乙醇各3 min，使切片脱蜡至水；在高压锅内加入PBS(pH 6.0)，煮沸后加热3 min对抗原进行高压热修复；切片用3%H2O2避光处理15 min后，在玻片上滴加一抗，4 ℃过夜；滴加鼠或兔二抗，室温孵育40～60 min；每张切片滴加100 μL显色液，室温孵育3～5 min，镜下观察到明显棕黄色时用PBS终止反应；将切片进行HE染色，按照苏木精3 min，流水冲洗5 mim，盐酸乙醇分化3 s，流水冲洗20 min，梯度乙醇脱水至二甲苯各5 min，切片晾干后封固。免疫组化结果判读：按照染色深浅，将肿瘤细胞染色强度分为四级，分别是阴性(-)、弱阳性(+)、中等阳性()和强阳性()，以中阳性和强阳性为过表达或高表达。

1.7 统计学分析采用SPSS 17.0或Office Excel软件进行统计学分析并绘制图表。对独立样本的统计检验，采用非配对t检验或单因素方差分析检验；所有统计检验均采用双尾检验和方差齐性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT抑制剂对黑色素瘤细胞电离辐射(ionizing radiation, IR)敏感性的影响彗星实验结果显示：黑色素瘤A357细胞的DNA损伤对IR呈现出剂量依赖性。随着辐射强度的增强，慧尾DNA占比增加(P<0.001)，提示随辐剂量增加，细胞DNA损伤越严重(图1A)；由于8.0 Gy IR对黑色素瘤细胞DNA损伤最明显，所以后续实验采用8.0 Gy为IR处理剂量。SIRT抑制剂处理下，黑色素瘤细胞对IR的敏感性增加，表现为彗尾DNA占比显著增加(P<0.001，图1B)。

图1 彗星电泳实验检测黑色素瘤细胞DNA损伤：A.彗星电泳分析IR对黑色素瘤细胞DNA损伤的剂量效应，柱状图显示黑色素瘤细胞DNA损伤的定量分析；B.彗星电泳分析SIRT抑制剂对黑色素瘤细胞IR敏感性的影响，柱状图显示黑色素瘤细胞DNA损伤的定量分析；**P<0.01,***P<0.001

2.2 干扰SIRT7对黑色素瘤细胞IR敏感性的影响qRT-PCR和Western bolt结果显示：与对照组(siNC)相比，siRNA干扰片段siSIRT7_01(AGCCATTTGTCCTTGAGGAA)和siSIRT7_02(GAACGGAACTCGGGTTATT)转染人黑色素瘤细胞A375后，在IR处理和非处理(MOCK)条件下，SIRT7蛋白和mRNA表达水平均明显减低(P<0.001，图2A、B)。彗星实验检测显示：随着辐射强度的增加，彗尾DNA占比增加(P<0.001)，提示细胞的DNA断裂点增多，损伤越严重(图2C)。

2.3 干扰SIRT7后转录组测序分析对干扰SIRT7后显著上调的基因进行GO富集分析后发现，被富集的GO中排名最靠前的包括：ATF6介导的未折叠蛋白反应、内质网伴侣复合物、错误折叠蛋白结合、内质网应激反应、内质网腔、PERK介导的未折叠蛋白反应、Atg8连接酶活性和巨自噬等(P<0.05，表1)。京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析表明，包括内质网中的蛋白质加工和自噬调节在内的分子途径受到显著影响(P<0.05，表1)。

图2 干扰SIRT7对黑色素瘤IR敏感性的影响：A.qRT-PCR检测SIRT7干扰片段效率，**P<0.01，***P<0.001；B.Western blot检测SIRT7干扰片段效率；C.彗星电泳分析干扰SIRT7对黑色素瘤细胞IR敏感性的影响，柱状图显示黑色素瘤细胞DNA损伤的定量分析

表1 干扰SIRT7后RNAseq结果的GO和KEGG通路分析

2.4 干扰SIRT7后内质网应激及自噬相关蛋白的表达在IR处理和非处理(MOCK)条件下，分别使用两个干扰片段干扰SIRT7，用Western blot法检测了内质网应激和自噬相关蛋白的表达。结果显示：干扰SIRT7后，与siNC相比，内质网应激相关蛋白XBP1和GRP78，自噬相关基因ATG3、ATG12及自噬标志物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显著上调(图3)。

图3 干扰SIRT7对内质网应激和自噬相关蛋白表达的影响

2.5 自噬抑制剂对SIRT7介导的黑色素瘤细胞自噬性死亡的影响采用Sytox Green染色黑色素瘤细胞，以识别和计算死亡细胞。在非IR治疗条件下，干扰SIRT7增加了死亡细胞数量，而自噬抑制剂3-MA的治疗降低了细胞凋亡率(P<0.05，图4)。IR治疗显著提高了黑色素瘤细胞的凋亡率，而干扰SIRT7则显著增强这一趋势。然而，3-MA可以在较大程度上缓解干扰SIRT7诱导的细胞死亡(P<0.05，图4)。因此，SIRT7缺失促进了黑色素瘤细胞的自噬性细胞死亡。

2.6 SIRT7与内质网应激和自噬相关蛋白表达的相关性免疫组化和Western blot结果显示：与siNC相比，干扰SIRT7后，MOCK组和IR处理组移植瘤中SIRT7表达降低。免疫组化染色显示：分别在MOCK和IR处理下敲除SIRT7，与siNC组相比，siSIRT7组XBP1、GRP78、ATG3、ATG12和LC3B表达均显著上调(图5A)。其中，siNC组SIRT7为()，XBP1、GRP78、ATG3、ATG12和LC3B均(-)；siSIRT7组SIRT7为(+)或()，XBP1、GRP78、ATG3、ATG12和LC3B为()。Western blot结果也证实：干扰SIRT7后，XBP1、ATG12和LC3B表达显著上调(图5B)。以上结果提示，SIRT7可能通过负性调节内质网应激和自噬基因相关基因的表达，保护黑色素瘤细胞，降低其放疗敏感性。

3 讨论

放疗是肿瘤重要的临床治疗方法，但黑色素瘤富含防辐射物质黑色素，是放疗抵抗较严重的人类肿瘤之一[9]。氧化应激、DNA复制、IR、紫外线辐射以及各种基因和毒素等内外压力，可增加人体细胞基因组的不稳定以及DNA损伤，最终导致衰老和肿瘤[10]。Sirtuins在调节应激反应等多种生物过程中发挥关键作用[11]。本组着重分析了Sirtuin家族成员SIRT7，明确其在黑色素瘤中的生物学功能和黑色素瘤细胞放疗抵抗中的作用与机制。SIRT7不仅参与基因组稳定性，DNA修复和线粒体内稳态，还能调节癌基因表达和核糖体发生等[12]。SIRT7能直接与DNA损伤位点结合，并招募下游因子DNA损伤进行修复，以维持基因组稳定性，是复杂的DNA损伤反应系统的重要组成部分[13]。SIRT7还在胃癌和乳腺癌等多种肿瘤中高表达，发挥促进细胞存活并抑制细胞凋亡的作用[6,14]。然而，自噬介导的SIRT7对肿瘤细胞的调控作用较少被探讨。在前列腺癌中，SIRT7通过促进雄激素受体信号通路增强雄激素诱导的自噬[15]。在胶质瘤中，长链非编码RNA MEG3通过调控SIRT7和PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导自噬[16]。尽管已有上述研究，但SIRT7在黑色素瘤中的作用尚不清晰。

本组证实SIRT7缺失导致DNA损伤增加。SIRT7可直接参与DNA损伤修复，而其在癌基因表达、线粒体内稳态、核糖体生物发生和内质网应激中也发挥重要作用[17-18]。内质网是一个巨大的膜网络，是膜蛋白和分泌蛋白重要的组装车间[19]。缺氧、氧化损伤、葡萄糖剥夺和辐射等内外刺激不仅损害内质网的蛋白质折叠能力，还可以诱导以EIF2α磷酸化为特征的内质网应激和接下来的未折叠蛋白反应[20]。未折叠蛋白反应信号能够上调伴侣基因表达，并诱导未折叠或错误折叠蛋白质的内质网相关降解，减少内质网的负担。然而，如果内质网应激程度超过“从生存到死亡”的阈值，就会通过诱导相关转录因子的表达来激活各种形式的细胞死亡[21]。自噬导致的细胞死亡称为自噬性细胞死亡，其主要特征是细胞质中出现大量的自噬体和自噬溶酶体，最终细胞被自身的溶酶体消化降解[22]。

图4 自噬抑制剂3-MA对SIRT7介导的细胞死亡的影响：A.Sytox Green染色显示死亡细胞；B.柱状图显示凋亡细胞数，*P<0.05

AMOCKIRsiNCsiSIRT7siNCsiSIRT7SIRT7GRP78XBP1ATG3ATG12LC3BB

图5 在体内干扰SIRT7对内质网应激和自噬的影响：A.免疫组化染色检测异种移植瘤中SIRT7以及内质网应激和自噬相关蛋白的表达；B.Western blot检测干扰SIRT7后，SIRT7以及内质网应激和自噬相关蛋白表达

SIRT7与内质网应激之间的关系鲜有报道。在慢性肝病中内质网应激可以诱导SIRT7表达，并与Myc相互作用富集在核糖体基因的启动子处，通过沉默其表达缓解内质网应激[23]。此时，SIRT7表达是由内质网应激诱导的。本组发现SIRT7缺失可诱导内质网应激的典型标志物XBP1和GRP78的表达，它们作为伴侣来纠正蛋白质折叠，为支持SIRT7作为黑色素瘤细胞内稳态的守护者提供新的证据。SIRT7敲低后转录组测序生物信息学分析提示，SIRT7在调节内质网应激介导的自噬中发挥作用。本组通过细胞学实验证实自噬基因ATG3和ATG12受SIRT7调控。ATG3作为E2样结合酶介导LC3脂质化，而ATG12是E3连接酶复合物之一，促进基础性自噬。此外，ATG3还可以与ATG12结合，形成复合物，连接晚期内溶酶体运输[24]。SIRT7缺失可激活的自噬增加错误折叠蛋白结合细胞死亡，属于自噬性细胞死亡。

综上，SIRT7可以负性调节内质网应激介导的细胞死亡，以增强黑色素瘤细胞的生存能力。本实验显示SIRT7在维持内质网稳态中发挥关键作用，内质网稳态有望成为放疗或其他应激诱导疗法中黑色素瘤治疗的新靶点。