裂隙淋巴细胞联合血细胞检测对百日咳的诊断价值

黄广丽 李军勤 李杰 赵丽静 张秀芳

20世纪50年代各国开展大规模的百日咳疫苗接种，百日咳发病率、病死率明显降低，然而据WHO统计全球仍有上千万患儿，百日咳仍是全球重要的公共卫生问题[1]。我国百日咳疫苗覆盖率较高，然而近年来我国百日咳发病率仍有升高，且有报道显示个别地区有暴发流行现象[2-3]。百日咳是由百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌引起的高度传染性急性呼吸道疾病[4]。0～4岁婴幼儿是百日咳发病率、病死率最高的人群，其中1岁以内患儿病死率高达60%，严重威胁婴幼儿生命健康[5]。百日咳早期诊断主要依赖患儿临床症状，但易发生不典型病例的误诊、漏诊，因此，实验室检测是该病诊断的重要依据。细菌培养法是诊断百日咳的金标准，虽然其特异度较高，但其灵敏度易受外界因素的影响，且不宜标准化。应用ELISA法定量检测抗百日咳毒素IgG抗体（PT-IgG）灵敏度、特异度均较高，但人体在接种疫苗后或急性期的患儿则无法检出且对其他鲍特菌、副百日咳鲍特菌缺乏诊断价值[6]。裂隙淋巴细胞存在于百日咳患儿外周静脉血中，基于ELISA法的不足与裂隙细胞的特点，本研究将裂隙淋巴细胞与血细胞检测进行联合，探讨本病合理的诊断方法。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年1月至2021年6月邯郸市妇幼保健院收治的疑似百日咳患儿108例为研究对象，其中男55例，女53例；年龄1～3（2.03±0.04）岁。根据百日咳杆菌核酸检测结果，分为观察组（百日咳杆菌核酸检测结果阳性）68例和对照组（百日咳杆菌核酸检测结果阴性）40例。观察组患儿男38例，女30例；年龄1～3（2.02±0.03）岁；对照组患儿男21例，女19例；年龄1～3（1.09±0.03）岁；两组患儿性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。纳入标准：（1）年龄＜5岁的住院患儿；（2）有上呼吸道症状需要鉴别诊断者；（3）阵发性、痉挛性咳嗽、咳嗽后伴发呕吐，存在呼吸暂停症状，鸡鸣样吸气性回声，结膜下出血，舌系带溃疡。排除标准：（1）近3个月有咳嗽、哮喘等症状；（2）存在自身免疫功能缺陷者；（3）气道畸形、先天性心血管畸形等引起的咳嗽症状者；（4）过敏性气道非特异性炎症，或存在明确病原菌所致的毛细支气管炎、气管炎等；（5）肿瘤、异物、淋巴结肿大等所致气道受压而引起的咳嗽者；（6）咽喉壁脓肿、会咽炎、腺样体肥大等胸腔外气道疾病者；（7）心、肝、肾等重要器官严重功能障碍者。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患儿家属均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 百日咳杆菌核酸检测 采用荧光PCR法。于患儿入院当天收集深部痰液，使用百日咳杆菌核酸测定试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司）测定百日咳杆菌核酸是否阳性。阳性判定：荧光PCR法检测到核酸序列即为阳性。

1.2.2 裂隙淋巴细胞计数检测 于患儿入院当天采集外周静脉血2 ml，将患儿血液进行手工推片制备合格血涂片2～3张，进行瑞氏染色。由有经验的检验医师在光学显微镜下观察计数100个有核细胞中裂隙淋巴细胞所占比例。裂隙淋巴细胞形态特点：细胞圆形、胞体较小，胞质量少、染色深，清透、无颗粒，细胞核型不规则、染色质浓缩且致密，细胞核可表现为对称的双核或分叶状、核仁缺失，或见深浅不等的切迹、裂缝。阳性判定：外周静脉血涂片中存在裂隙淋巴细胞即为阳性。

1.2.3 WBC及淋巴细胞百分比检测 于患儿入院当天采集外周静脉血2 ml，使用SysmexXE-5000全自动血细胞分析仪检测WBC及淋巴细胞百分比。阳性判定：WBC＞12×109/L、淋巴细胞百分比＞50%即为阳性。

1.2.4 PT-IgG检测 采用ELISA法。于患儿入院当天采集外周静脉血2 ml，并进行血清分离，保存于-20℃环境下，待检。严格按照试剂盒操作步骤进行抗体检测，阳性判定：超过同年龄组健康儿童百日咳特异性抗体检测结果均数＋2个标准差者即为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。方差不齐的计量资料以表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；两组性别的差异及不同指标间灵敏度与特异度比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿镜下裂隙淋巴细胞形态 108例患儿中，42例患儿血涂片中可见数量不等的裂隙淋巴细胞。显微镜下可见细胞质呈浅蓝色透亮状或蓝色，且数量较少，无核仁；细胞体积小，圆形，染色较深且胞质量少；细胞核染色质聚集为深紫色且可见明显裂隙，该裂隙贯穿于整个细胞，表现为不对称双核样或双核样。

2.2 两组患儿裂隙淋巴细胞计数、WBC、淋巴细胞百分比、PT-IgG水平比较 观察组患儿裂隙淋巴细胞计数、WBC、淋巴细胞百分比、PT-IgG水平均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1。

表1 两组患儿裂隙淋巴细胞计数、WBC、淋巴细胞百分比、PT-IgG比较

2.3 不同指标灵敏度与特异度比较 108例患儿中，裂隙淋巴细胞计数阳性42例、WBC阳性63例、淋巴细胞百分比阳性71例、PT-IgG阳性14例。裂隙淋巴细胞计数灵敏度为 0.588（40/68），特异度为 0.950（38/40）；WBC灵敏度为0.809（55/68），特异度为0.800（32/40）；淋巴细胞百分比灵敏度为0.838（57/68），特异度为0.650（26/40）；PT-IgG灵敏度为0.192（13/68），特异度为0.975（39/40），见表2。裂隙淋巴细胞计数特异度高于WBC、淋巴细胞百分比，差异均有统计学意义（χ2=22.31、30.04，均P＜0.05），而灵敏度均低于前两者，差异均有统计学意义（χ2=18.72、22.41，均P＜0.05）。裂隙淋巴细胞计数与PT-IgG特异度比较差异无统计学意义（χ2=0.35，P＞0.05）。

表2 不同指标阳性情况（例）

3 讨论

百日咳主要通过飞沫经呼吸道传播，以人体为主要宿主，其高发人群为婴幼儿[7]。近年来百日咳发病率呈明显上升趋势，有学者提出“百日咳再现”[8]，且随着百日咳疫苗的应用，患儿临床表现不典型，给该病的早期诊断带来困难，易发生漏诊、误诊，而延误治疗则会导致并发症发生率、病死率的升高[9]。目前，关于百日咳的实验室诊断主要有病原学、血清百日咳毒素检测、鼻咽拭子[10-13]。细菌培养是百日咳诊断的金标准，但该方法检测周期长，且百日咳存在1～2周潜伏期，导致其在基层医院开展困难，因此，探讨简便、快捷、准确的实验室检测方法是控制传染的关键。

本研究显示，观察组患儿WBC、淋巴细胞百分比、PT-IgG水平均明显高于对照组。百日咳毒素能够促进淋巴细胞增殖、提高白细胞水平的免疫效应，因此百日咳患儿的实验室检查结果可见WBC、淋巴细胞异常[14-16]。虽然，淋巴细胞增多是百日咳的重要检测特征，但从本研究来看，淋巴细胞在百日咳患儿中的特异度较低。Qing等[17]研究显示，裂隙淋巴细胞由百日咳毒素诱导产生，从本研究来看裂隙淋巴细胞特异度明显高于WBC、淋巴细胞百分比，这与Qing等[17]研究结果一致。有学者指出，从外周静脉血涂片中读取裂隙淋巴细胞计数是快速、简单的百日咳诊断方法[18]。本研究显示，裂隙细胞在镜下有明显的形态特征，易辨识，且外周静脉血取样、观察简单易行，适合在基层医院开展。史海燕[19]对100例疑似百日咳病患儿进行百日咳毒素IgG抗体检测，结果显示抗体阳性率为22%，说明抗体检测的灵敏度不高，若单纯依靠抗体检测容易漏诊。

综上所述，结合百日咳临床表现，当患儿外周静脉血WBC、淋巴细胞百分比升高，且观察到裂隙淋巴细胞时应高度怀疑百日咳。在未获得细菌培养的金标准结果时，注重显微镜下细胞形态变化对百日咳早期筛查具有重要意义。鉴于有报道指出，裂隙淋巴细胞可见于白血病、淋巴瘤患者外周静脉血中[20]，故不能将裂隙淋巴细胞作为百日咳的单一诊断依据。本研究显示裂隙淋巴细胞阳性的40例患儿中有38例确诊百日咳感染，特异度为0.950，再次证明裂隙淋巴细胞出现与百日咳感染有关，可作为百日咳的特异性指标，考虑到裂隙淋巴细胞灵敏度低于特异度的特点，在临床实验室诊断中可将裂隙淋巴细胞计数与WBC、淋巴细胞百分比相结合，采取3者联合诊断策略，以提高百日咳诊断的准确性。外周静脉血涂片观察裂隙淋巴细胞联合血细胞检测对百日咳诊断具有缩短诊疗时间、节约医疗成本的积极意义。