载脂蛋白E基因多态性与脑卒中合并抑郁的相关性分析

梁杰 华深 戴边 叶素红

抑郁症是一种临床常见的精神类疾病，在普通人群中患病率约为10%～15%，以兴趣减退或情感低落为主要临床特征，伴躯体症状、行为紊乱、认知功能障碍等[1]。脑卒中是我国常见的慢性疾病之一，该病具有较高的发病率、致残率及致死率等，严重威胁患者的身体健康[2]。卒中后抑郁症是脑卒中患者常见的一种并发症，以兴趣减退、情绪低落、情绪障碍等为主要表现，发病率约为20%～79%[3]。由于脑卒中合并抑郁会影响患者的治疗效果，延长治疗时间，降低其生活质量，严重者可致残甚至死亡，给患者家庭带来巨大心理压力和经济负担[4]，故选取有效指标预测脑卒中合并抑郁的发生具有重要临床意义。载脂蛋白E（apolipoprotein E,APOE）是一种多肽，由单一多肽链构成，主要存在于多种脂蛋白颗粒中，APOE mRNA主要存在于大脑及肝脏。APOE与心脑血管性疾病相关，是动脉粥样硬化和脑卒中的危险因素，有研究发现APOE对脂质代谢具有调节作用，使胆固醇维持在正常水平，在动脉粥样硬化的发生、发展及神经功能损伤的修复中也扮演了关键角色[5-6]。Ramachandran等[7]在研究抑郁症时发现，APOE ε3ε4基因型与抑郁症相关，首次提出APOE基因多态性与抑郁症的关系。关于APOE基因多态性与抑郁情绪的研究指出，携带APOE ε4等位基因的抑郁症患者发病次数较多和发病年龄较早，APOE基因多态性影响抑郁症的临床特征和病程[8]。APOE基因多态性可能是脑卒中合并抑郁的潜在发病机制之一，但目前关于APOE基因多态性与脑卒中合并抑郁的相关性研究较少。基于此，笔者旨在探讨APOE基因多态性与脑卒中合并抑郁的相关性，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2020年1月至2021年2月平湖市第一人民医院及金华市第二医院收治的118例（各59例）脑卒中患者。脑卒中合并抑郁的诊断标准：（1）脑卒中根据《脑梗死和脑出血中西医结合诊断标准（试行）》[9]中的诊断标准，且经头颅MRI和CT检查证实；（2）抑郁症的诊断标准：汉密尔顿抑郁量表（Hamilton depression scale,HAMD）[10]评分＞20分，且符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版（DSM-4）中抑郁症的诊断标准。纳入标准：（1）符合上述诊断标准，且为首次发作者；（2）处于康复期，意识清楚，病情稳定，智力正常，无沟通障碍者；（3）无药物、酒精依赖史；（4）均签署知情同意书。排除标准：（1）既往有抑郁或精神病史者；（2）体内有金属异物者；（3）言语、视力或听力功能障碍，无法配合相关评测者；（4）合并心、肝、肺、肾等重要脏器功能衰竭者；（5）因其他器质性疾病继发抑郁者；（6）依从性差者。根据是否合并抑郁症分为合并抑郁症组48例和单纯脑卒中组70例。两组患者性别、年龄、脑卒中病程、病变性质、卒中部位、HAMD评分、吸烟、饮酒、合并症等比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。本研究经平湖市第一人民医院医学伦理委员会批准（20200105）。

表1 两组患者一般资料的比较

1.2 基因多态性检测 所有患者入院后1 d抽取空腹静脉血8 ml。血液DNA采用美国Sigma公司NA2010 GenElute Blood Genomic DNA Kit提取，提取方法为冷冻血室温溶化；取1 ml血液置于2 ml无菌离心管中，加入等体积的PBS，混匀后12 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入667 μl缓冲液，20%裂解细胞24 μl，37 ℃水浴1 h；加入20 mg/ml蛋白酶K 10 μl混匀，55 ℃水浴消化过夜（10～14 h）；将消化的样品分别加入等体积的Tris饱和酚，酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）充分振荡混匀，12 000 r/min离心10 min；加入2倍体积的冰乙醇，1/10体积醋酸钠水平摇动，直到可见絮状DNA析出；样品-20℃冰箱冷冻30 min，取出后12 000 r/min离心10 min，使DNA沉淀；洗出DNA的杂质；将DNA用真空干燥或自然晾干，加入适量的TE缓冲液回溶，-20℃冰箱内保存备用。取DNA 4 μl，稀释25倍，DNA质量、浓度及260nm和280nm吸光度（optuical densit,OD260/280）采用紫外分光光度检测。由上海英俊生物技术有限公司合成APOE基因引物序列，下游：5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3'，上游：5'-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3'。PCR 体系（10 μl）：DNA 模板（1 μl）、dNTPs（0.3 μl）、上游/下游引物（0.2 μl）、10×Buffer（1 μl）、MgCI（20.52 μl）和ddH2O（6.68 μl）；扩增后酶切体系：10 μl（10 U/μl）HhaI，10 μl PCR产物，加入去离子水使总体积达到30 μl，混匀，37℃水浴12 h，消化。用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳反应结束后的酶切产物，分辨基因型。PCR扩增：离心固体引物（10 000 r/min离心10 min），加入离子水，混匀，引物稀释至100 pmol/L，保存于-20℃冰箱内。PCR反应条件：94℃ 4 min，1个循环；94℃ 45 s，退火温度45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min，1个循环；4℃保存。5%琼脂糖电泳对反应后PCR产物的扩增效果进行观察。

APOE基因的ε2、ε3、ε4等位基因构成ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4、ε3ε4共6种不同基因型。等位基因频率=（[2×纯合子＋杂合子）（/2×受检总例数）]×100%。比较两组患者APOE基因型分布及等位基因频率的差异。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。采用多因素logistic回归分析脑卒中合并抑郁的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者基因型分布的比较 合并抑郁症组ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4、ε3ε4占比与单纯脑卒中组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 两组患者基因型分布的比较[例（%）]

2.2 两组患者等位基因频率的比较 合并抑郁症组ε2、ε3基因频率与单纯脑卒中组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；合并抑郁症组ε4高于单纯脑卒中组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组患者等位基因频率的比较[例（%）]

2.3 脑卒中患者抑郁影响因素分析 以脑卒中患者合并抑郁为因变量，将上述一般资料、基因型分布及等位基因频率为自变量，多因素logistic回归分析结果显示，ε2ε3、ε3ε4、ε4是脑卒中合并抑郁的影响因素，见表4。

表4 多因素logistic回归分析脑卒中合并抑郁的影响因素

3 讨论

抑郁症是脑卒中常见的并发症之一，抑郁症可在脑卒中后的任何时期发生，其不仅危害脑卒中患者的心理健康，而且严重影响患者神经康复，加重病情，延长病程。目前有研究认为，抑郁症是社会心理学和神经生物学共同作用而产生的结果，其中社会心理学包括社会与家庭影响、群体行为学等，神经生物学机制则涉及神经再生学、神经营养学、神经递质学等[11]。近年来，关于脑卒中合并抑郁发病机制的相关研究中基因多态性是临床研究的重点[12]。目前已有文献对APOE基因多态性与抑郁症、冠心病等继发抑郁障碍的关系展开研究，但结论并不一致[13-14]。而APOE基因多态性是否与脑卒中合并抑郁相关的研究甚少。

APOE基因长度约3.7 kb，位于19q13.2，有3个等位基因包括ε2、ε3、ε4，共同构成6种基因型，包括杂合子（ε3ε4、ε2ε4、ε2ε3）和纯合子（ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4），在多种脂蛋白颗粒中存在，首次在极低密度脂蛋白中发现，参与脂质代谢，其基因多态性参与神经细胞的生长及修复[15]。APOE属于一种多功能蛋白，主要通过与极低密度脂蛋白受体和低密度脂蛋白受体结合发挥胆固醇转运和脂类代谢；另外，APOE与神经系统正常发育密切相关，且参与抗氧化、免疫应答、脂质的再分布、组织损伤后修复等过程[16]。在中枢神经系统中，APOE由星形胶质细胞合成，是重要的载脂蛋白，与脂质的转运密切相关，修复神经组织[16]。APOE异构体由ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4所编码合成，其结构和功能并不相同，因此其在神经生物学上所发挥的作用也并不相同。脑卒中发生的重要危险因素包括脑内β-淀粉样蛋白和神经纤维缠结的形成，其原因可能是APOE ε2、ε3等位基因的缺失会加速神经纤维缠结的形成，另外APOE ε4等位基因与脑卒中患者脑内β-淀粉样蛋白密切相关[16]。有研究指出，APOE基因多态性参与抑郁的发生、发展[17]。孔咏梅等[5]研究指出，脑梗死合并认知功能障碍患者的APOE基因型分布与脑梗死患者并无明显区别。Feng等[18]研究指出，APOE基因多态性与抑郁症易感性关系密切。本研究结果显示，合并抑郁症组 ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4、ε3ε4与单纯脑卒中组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），提示脑卒中及脑卒中合并抑郁的APOE基因型分布并无明显区别。本研究结果显示，合并抑郁症组ε2、ε3与单纯脑卒中组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），但ε4高于单纯脑卒中组（P＜0.05），提示脑卒中合并抑郁的APOE等位基因频率中ε4较高，这可能是由于ε4等位基因与脑卒中合并抑郁中存在一定的关系，但具体机制需进一步研究证实。

于雪莹等[6]研究指出，2型糖尿病患者脑梗死的发生与APOE基因型关系密切。Das等[19]研究指出，在脑梗死的APOE基因型ε3ε4中TG、极低密度脂蛋白胆固醇水平呈高表达。张晋霞等[20]研究则认为，蛛网膜下腔出血性脑卒中、出血性脑卒中及缺血性脑卒中等各类脑卒中受APOE ε4等位基因影响，增加其发病率。胡艳清等[21]研究也证实，颈动脉内膜中层厚度与APOE ε4等位基因密切相关，可促使脑梗死的患病率增加。由此可推测，APOE基因型ε3ε4、ε4等位基因会对人体机体内的脂类代谢产生影响，特别是脑内脂类的代谢，有利于形成脑内动脉粥样硬化，增加脑梗死的发生率。Taylor等[22]通过动物研究发现，APOE ε4等位基因会诱发动物发生代谢紊乱，从而引发脑梗死。Scott等[23]研究指出，抑郁的发生与APOE基因多态性相关，APOE基因多态性可能是抑郁症的影响因子。Lavretsky等[8]研究发现，抑郁症患者携带APOE ε4等位基因则发病年龄较年轻、发病次数较多，证实APOE ε4等位基因与抑郁症的临床特点及病程密切相关。Ramachandran等[7]研究指出，脑卒中患者合并抑郁与APOE ε4等位基因相关。本研究结果显示，ε2ε3、ε3ε4、ε4是脑卒中患者伴抑郁的影响因素，与上述研究结果一致，其原因可能是APOE ε4等位基因会对机体内的代谢产生影响，诱导脑血管动脉粥样硬化，影响脑血管供血，对情感调节区域造成影响，阻断相关通路，从而抑制相关神经调节因子。

综上所述，脑卒中合并抑郁患者APOE等位基因频率中ε4较高，ε2ε3、ε3ε4、ε4是脑卒中合并抑郁的影响因素。由此得出，APOE基因多态性与脑卒中合并抑郁密切相关，检测APOE基因多态性，有助于预测脑卒中合并抑郁的发生风险。