杜仲叶总黄酮对去卵巢大鼠肠道菌群的影响

张云 薛柯 代俊俊苏亚菲李钦

1 河南省杜仲栽培与利用工程实验室,河南 开封 475004;2 河南大学 药学院,河南 开封 475004;3 河南大学 医学院,河南开封475004

绝经后骨质疏松(Postmenopausal Osteoporosis,PMO)属于原发性骨质疏松症,是妇女绝经后常见的疾病之一,以骨量减少、骨微结构破损、骨脆性增加、易发生骨折为主要特征的全身性骨骼疾病[1]。正常的肠道微生物群是骨量的调节剂,通过调节机体的代谢及免疫状态来调节骨代谢,对维持骨稳态平衡起着至关重要作用[2]。绝经后女性肠道菌群种属比例骤变,免疫细胞和炎症因子激增,促进破骨细胞分化成熟,增强骨溶解吸收,导致骨质疏松[3]。因此,肠道微生物群与骨代谢的关系成为目前的研究热点。

杜仲叶是杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥叶。在《中华人民共和国药典》2020年版中,杜仲叶具有补肝肾,强筋骨的功效,用于肝肾不足,头晕目眩,腰膝酸痛,筋骨痿软[4]。近年来研究[5]发现,杜仲叶的主要活性成分为木脂素类、黄酮类、环烯醚萜类化合物。杜仲叶中的总黄酮含量高达10.05%[6]。黄酮类化合物广泛存在于自然界植物中,具有多种生理活性和药理作用。近年来,黄酮类化合物在骨质疏松方面的研究取得了一定进展,有研究表明黄酮类化合物具有改善骨微结构和提高骨密度的功能,达到预防和治疗骨质疏松的目的[7]。本实验采用高通量测序技术研究杜仲叶总黄酮对去卵巢大鼠肠道菌群多样性的影响,以期为用杜仲叶总黄酮预防和治疗骨质疏松提供数据支撑。

1 实验材料

1.1 药物与试剂

杜仲叶总黄酮(实验室自制,总黄酮含量＞80%);常规饲料购自于斯贝克思有限公司;注射用青霉素钠(哈药集团,批号20110319-2)。

粪便基因组DNA 提取试剂盒(Magen,Mag-Pure Soil DNA LQ Kit),Qubit dsDNA 检测试剂盒(Life Technologies,Qubit dsDNA Assay Kit),TksGflex DNA 聚合酶(Takara,TksGflex DNA Polymerase)。

1.2 仪器

Centrifuge 5418台式高速离心机(Eppendorf,Centrifuge 5418);高分辨率活体X 射线显微成像仪(德国Bruker,SkyScan 1276);NanoDrop超微量分光光度计(Thermo Fisher,2000);PCR 仪(Biorad,580BR10905);高通量核酸提取仪(QIAGEN,SN 002358);生化分析仪(Aglient,2100)。

1.3 动物

SPF级3月龄雌性SD 大鼠32只,体质量240±10 g,购自于济南彭悦实验动物繁育有限公司,实验动物合格证号SCXK(鲁)20190003。SD 大鼠饲养于SPF级动物房,保持室温20±2 ℃,自由饮水和进食。

2 实验方法

2.1 去卵巢大鼠模型

大鼠适用性饲养一周后采用随机数字法分为4组,每组8只,分别为假手术组、模型组、雌二醇组(阳性对照)和杜仲叶总黄酮组。假手术组仅切除双侧卵巢周围等量脂肪,其余各组均由背部行双侧卵巢摘除术[8]。术后3天内每天注射青霉素G8万IU,并用碘伏消毒,预防感染。术后一周起,开始每天灌胃给药,杜仲叶总黄酮组给药剂量为200 mg/(kg·d-1),雌二醇组给药剂量为0.208 mg/(kg·d-1),假手术组和模型组灌胃同等体积的蒸馏水,每日给药一次,连续给药13周。

2.2 标本的采集

各组大鼠按照对应药物治疗13周,最后一次灌胃禁食不禁水24 h后,用体积分数为10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,采集标本。剖腹在回盲部做一V 形剪切口,灭菌牙签收集粪便放入冻存管中保存于-80℃以备16S r RNA 基因测序。剥取子宫,滤纸吸干水分后称重。剥离出大鼠双侧股骨,剔除附着的肌肉及结缔组织,股骨采用75%乙醇固定,并保存于透明离心管中备用。

2.3 骨组织Micro-CT扫描

将股骨从体积分数为75%乙醇中取出,对标本进行固定处理后进行Micro-CT 扫描。由软件计算出组织的骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和结构模型指数(SMI)等参数。

2.4 肠道菌群的高通量测序

采用DNA抽提试剂盒对样本的基因组DNA 进行提 取,以343F TACGGRAGGCAGCAG 和798R AGGGTATCTAATCCT 为引物,对16S rRNA 可变区(V3+V4)进行PCR扩增,引物由赛维尔有限公司合成。Illumina MiSeq测序生成原始双端序列。使用Trimmomatic(0.35)、Flash(version 1.2.11)、split_libraries(version 1.8.0)和UCHIME(version 2.4.2)进行原始数据的预处理,得到用于OUT(Operational Taxonomic Unit)划分的va-lid tags。使用Vsearch(version 2.4.2)软件,对质控得到的优质序列valid tags按照97%的相似度进行OTU分类,并选取每个OTU 中丰度最大的序列作为该OTU的代表序列,采用RDP Classifier Naive Bayesian分类算法对代表序列与Silva(V138)数据库进行比对注释,得到OTU 的注释信息,并进行alpha多样性和beta多样性分析。

2.5 统计学方法

数据分析采用GraphPad Prism 8.0 处理。采用平均值±标准差()表示,各组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠体重及子宫指数

见表1所示,实验前,各组大鼠体重无统计学意义。实验3 mon后,模型组大鼠的体重显著高于假手术组(P＜0.01),而杜仲叶总黄酮组和模型组相比,大鼠体质量增加有所降低,但无显著性差异(P＞0.05),说明杜仲叶总黄酮有降低去卵巢大鼠体重的趋势。与假手术组相比,模型组大鼠的子宫系数显著低于假手术组(P＜0.001),具有统计学差异;而杜仲叶总黄酮组大鼠子宫系数与模型组接近,说明杜仲叶总黄酮对子宫无毒副作用,安全性高。

表1 大鼠体重和子宫指数(n=8,)

表1 大鼠体重和子宫指数(n=8,)

注:与假手术组相比,a P＜0.01,b P＜0.001。

3.2 骨组织Micro-CT扫描结果

由大鼠股骨Micro-CT 成像分析3D 图可以看出(见图1),假手术组大鼠的骨小梁排列紧密,分离度小,而模型组大鼠的骨小梁排列明显疏松,骨小梁间存在较大的间隙。与假手术组相比,模型组的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量均显著降低(P＜0.001),且骨小梁分离度和结构模型指数均显著增加(P＜0.001),说明造模成功。经杜仲叶总黄酮治疗后,与雌二醇组结果较类似,显著提高了大鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量(P＜0.05)降低了骨小梁分离度和结构模型指数(P＜0.01)。见图2。

图1 大鼠的股骨Micro-CT图像

图2 骨组织形态计量学指标

3.3 OTU 水平的Venn分析

根据聚类得到OTUs分析结果,绘制成韦恩图,图中每个圈代表一个组,同时存在于多个组的,用其重叠部分的数字表示。聚类后共获得615 种OTU,其中假手术数组、模型组、雌二醇组和杜仲叶总黄酮组的肠道菌群物种丰富程度不同,OTU 种类分别为280 种、265 种、282种和287 种,特有OTU 种类分别为91、88、86和101种。这一结果表明,摘除卵巢使大鼠粪便菌群丰度有所降低,给药后各组粪便菌群丰度均有所增加。见图3。

图3 OTUs的Venn分析图

3.4 Alpha多样性分析

Alpha多样性分析用于反映样品内的微生物多样性程度。Alpha多样性指数中的Shannon指数反映群落多样性,Chao1 和Observed species指数反映样品中菌落的丰富度。见图4所示,与假手术组相比,模型组的Chao1 指数、Observed species 指数、Shannon指数显著降低(P＜0.05),差异具有统计学意义,说明模型组的肠道微生物丰度和多样性低于假手术组;与模型组相比,杜仲叶总黄酮组的Chao1指数、Observed species指数、Shannon指数显著升高(P＜0.05),说明杜仲叶总黄酮组样本的肠道微生物丰度和多样性高于模型组。

图4 Alpha多样性分析

3.5 Beta多样性分析

Beta多样性为生境间的多样性程度,即比较不同分组样本的差异。本实验进行主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCo A),并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图。样本物种组成结构越相似,反映在PCo A 图中的样本距离越近,见图5。由图可知,假手术组与模型组明显分开,说明两组之间物种组成结构差异显著,杜仲叶总黄酮组与假手术数组之间的距离明显缩短,说明给药后的大鼠肠道菌群组成趋向于假手术组。

图5 Beta多样性分析

3.6 物种相对分布

3.6.1 在门分类水平上的组成

在假手术组样本中,其肠道菌群排名前五位的优势门类为拟杆菌门(Bacteroidetes)比率是53.678%,厚壁菌门(Firmicutes)比率是38.860%、螺旋菌门(Spirochaetes)比率是4.699%、Campilobacterota比率是1.175%、变形菌门(Proteobacteria)比率是0.628%,其它菌门所占比率为0.960%。在模型组样本中,其肠道菌群排名前五位的优势门类为拟杆菌门(Bacteroidetes)比率是58.108%,厚壁菌门(Firmicutes)比率是37.171%、螺旋菌门(Spirochaetes)比率是2.937%、变形菌门(Proteobacteria)比率是0.903%、Campilobacterota比率是0.348%,其它菌门所占比率为0.533%。与假手术组相比,模型组中的拟杆菌门比率有升高趋势,Campilobacterota比率明显下降。在杜仲叶总黄酮给药组样本中,其肠道菌群排名前五位的优势门类为拟杆菌门(Bacteroidetes)比率是52.991%,厚壁菌门(Firmicutes)比率是43.080%、变形菌门(Proteobacteria)比率是1.238%、Campilobacterota比率是1.137%、螺旋菌门(Spirochaetes)比率是0.874%、,其他菌门所占比率为0.680%。与模型组相比,杜仲叶总黄酮组能降低拟杆菌门比率,提高Campilobacterota比率。由此可见,三组动物肠道菌群虽然在前五大优势门类种类相同,但各优势门类所占比例各不相同,杜仲叶总黄酮组的第三大优势门类是变形菌门而在模型组和假手术组的第三大优势门类为螺旋菌门。见图6。

图6 样本肠道菌群门水平的相对丰度图

3.6.2 属分类水平上的组成

见图7所示,在假手术组样本中,其肠道菌群排名前五位的优势菌属为Prevotella比率为21.932%、Muribaculaceae比率为21.784%、Lactobacillus比率为6.293%、Clostridia_UCG-014比率为5.083%、Treponema比率为4.630%。在模型组样本中,其肠道菌群排名前五位的优势菌属为Prevotella 比率为39.615%、Muribaculaceae比率为10.269%、Lactobacillus的比率为4.375%、Clostridia_UCG-014的比率为2.914%、Treponema 比率为2.869%。与假手术组相比,模型组中的Prevotella的菌群比率显著升高,而Muribaculaceae菌群比率明显降低。在杜仲叶总黄酮给药组样本中,其肠道菌群排名前五位的优势菌属为Muribaculaceae比率为20.379%、Prevotella 比率为13.425%、Clostridia_UCG-014比率为4.695%、Lactobacillus比率为2.992%、Lachnospiraceae_NK4A136_group比率为2.970%。与模型组相比,杜仲叶总黄酮组能显著降低Prevotella菌群比率,提高Muribaculaceae菌群比率。由此可见,虽然在三组动物中的肠道菌群在前五大优势菌属大致相同,但每一种菌属所占比率各不相同。

图7 样本肠道菌群属水平的相对丰度图

4 讨论

骨重塑过程主要由破骨细胞的骨吸收作用和成骨细胞的骨形成构成。绝经后女性由于卵巢功能衰退,卵巢分泌的雌激素水平降低,致使骨代谢紊乱、骨量降低、骨密度下降,最终引发的一种代谢性疾病[9]。研究[10]发现,雌激素不仅能抑制成骨细胞、T细胞和B细胞分泌RANKL,还可以增加RANKL的竞争性受体骨保护素的水平。T 细胞可以增加骨微环境中TNF-α 的含量,TNF-α 可通过促进RANKL的表达,间接调节破骨细胞的生成,引起骨质流失[11]。本研究中模型组大鼠骨密度显著降低,骨小梁连接密度减小且结构受损。而经杜仲叶总黄酮治疗后,骨密度、骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度均有所升高,而骨小梁分离度和模型结构指数都有所降低,说明杜仲叶总黄酮能改善骨微结构。

近年来有研究表明,肠道菌群与机体骨代谢调控密切相关。肠道菌群是人体最大的微生物系统,与人体健康密切相关,其数量是人类细胞的数十倍,可通过多种途径调节骨代谢,主要包括钙和磷酸盐吸收、免疫调节等方面[12]。有研究发现,无菌小鼠骨量高于正常小鼠、骨矿物质密度和骨体积分数增加,并且骨吸收标记物含量降低,说明肠道菌群对骨代谢有调控作用[13-14]。本研究发现去卵巢模型大鼠肠道菌群多样性低于假手术组。去卵巢模型大鼠的肠道菌群严重失调,其中瘤胃球菌属、梭菌属和粪球菌属与破骨性指标呈正相关,并与去卵巢大鼠骨量丢失的趋势一致[15]。在本实验中,与假手术组相比,模型组的的Prevotella(普雷沃菌属)的丰度有所增加。厚壁菌门细菌特具有免疫调节作用,可促进调节性Treg细胞的形成,维持免疫系统稳态,并且还可以抑制破骨细胞分化,影响破骨细胞形成[16]。在本研究中,去卵巢大鼠经杜仲叶总黄酮干预后Bacteroidota丰度减少,同时能够提高的Firmicutes丰度,并提高去卵巢大鼠骨量,表明杜仲叶总黄酮可以通过肠道菌群改善绝经后骨质疏松的骨代谢进程,但其具体机制尚不清楚。

本实验初步探讨了杜仲叶总黄酮对去卵巢模型大鼠骨微结构和肠道菌群多样性的影响。发现杜仲叶总黄酮能改善去卵巢模型大鼠的股骨微观结构,提高骨密度,同时还能影响肠道菌群的Alpha、Beta多样性和菌群组成,从而有效的缓解绝经后骨质疏松症。由于本实验未设计机制研究,杜仲叶总黄酮对肠道菌群及骨免疫的作用机制还有待进一步实验探讨和验证。