栀子苷对结直肠癌细胞增殖和凋亡及Akt/MDM2/p53 通路的影响

于雅勤 沈加熙 张 虹

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范围内最常见、最致命的恶性肿瘤之一[1]。由于缺乏早期症状和有效的筛查策略，患者诊断时通常为晚期[2]。虽然CRC 分子靶向治疗和免疫治疗已取得重大进展[3]，但患者的预后仍较差。因此，寻找一种有效的CRC 治疗方式并探索其潜在的调控机制十分必要。从药用植物或草药中提取的天然产物是治疗CRC的重要补充疗法[4]。栀子苷（geniposide，GEN）是一种类环烷苷，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种生物活性[5-6]。研究表明，GEN 通过阻断HepG2 和HuH7 细胞Wnt/β-catenin 和AKT 级联通路抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用[7]。然而，GEN对CRC 的影响和作用机制仍不清楚。因此，本研究旨在探讨GEN 对CRC 细胞增殖及凋亡的影响及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1试 剂 GEN（批号YRZ005，纯度：≥98%）购自仪睿生物科技有限公司，胎牛血清（批号10099141C）、Dulbecco 改良Eagle’s 培养基（DMEM，批号11965092）购自美国Gibco 公司，四甲基偶氮唑盐（MTT，批号11465007001）、二甲基亚砜（DMSO，批号276855）购自美国Sigma 公司，Annexin V-FITC/PI 双染试剂盒（批号556419）购自BD Biosciences 公司，一抗p-Akt（sc-271964）、Akt（sc-81434）、p-MDM2（sc-53368）、p-p53（sc-135772）、p53（sc-393031）、MDM2（sc-5304）、cyclin B1（sc-7393）、Bcl-2（sc-7382）和β-actin（sc-47778）购自Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2细胞来源及培养 人CRC 细胞系（HCT-8、SW-480、HT-29、DLD-1）和人永生化健康结肠细胞CCD-18Co 来自中国科学院（上海）细胞库。细胞系置于含10%胎牛血清、1U/mL 青霉素G、1μg/mL 链霉素的DMEM，在37℃和5%CO2的潮湿环境中培养和维持。

1.3细胞活力测定 CRC 细胞（2×105细胞）和CCD-18Co 细胞（5×104细胞）接种于96 孔板中，用不同浓度（0～200μM）的GEN 孵育24h 或48h 后每孔加入30μL 的5mg/mL 四甲基偶氮唑盐（MTT）溶液，37℃孵育4h，去掉培养液，加入150μL DMSO 溶解甲醛晶体。使用微板阅读器在540nm 处读取每个样品的吸光度。计算所有细胞系的半数抑制浓度（IC50），其中一株细胞在进一步的实验中被用来阐明GEN 的作用机制。

1.4流式细胞仪分析细胞凋亡与周期 收集SW480 细胞经不同浓度（0、50、100 和150μM）GEN处理48h 后，用胰蛋白酶消化细胞，用PBS 洗涤，并在20℃的70%乙醇中固定过夜，然后与RNase（1mg/mL）孵育并用碘化丙锭（PI）（50μg/mL）染色。使用BD FACS Calibur 仪器通过流式细胞术确定DNA 含量。测定细胞凋亡时，用冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，在含有Annexin V-FITC 和PI 的300μL 溶液中，室温黑暗中染色15min。随后，用流式细胞术检测荧光信号。Annexin V-FITC/PI 图上象限定位用于区分活细胞（FITC-/PI-）、早期凋亡细胞（FITC+/PI-）和晚期凋亡或坏死细胞（FITC+/PI+）。

1.5Western blot 分析 SW480 细胞经GEN 处理48h 后，在裂解缓冲液中裂解30min。变性蛋白样品（20μg）装入10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中。电泳分离后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含10%脱脂牛奶的封闭液封闭后，用含0.1%（v/v）吐温-20 的磷酸盐缓冲液（PBS-T）洗涤，然后与一抗（1∶1000）在4℃孵育2h。用PBS-T 洗涤后，用与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1h，最后，使用增强化学发光（ECL）试剂（GE Healthcare）可视化蛋白质条带。

1.6Akt 基因敲低和转染 为建立稳定的AKT 基因敲低细胞，将慢病毒质粒（shAKT1 和shAKT2）与包装载体（psPAX2 和PMD2.G）用转染试剂共转染HEK293T 细胞。用0.45μm 滤器过滤收集病毒颗粒，将病毒颗粒保存在-80℃中，用8μg/mL 聚乙烯胺（微孔）感染培养的CRC 细胞24h，然后用嘌呤霉素（1μg/mL）筛选36h，用于后续实验。

1.7免疫荧光法 用TBS 洗涤细胞，4%多聚甲醛固定15min 后，用含0.1%Triton X-100 和1%牛血清白蛋白的1%牛血清白蛋白在37℃通透性封闭1h，然后与抗p53 抗体（1∶500）和MDM2 抗体（1∶500）共同孵育，在4℃轻度摇晃过夜。然后用PBS 洗涤细胞，分别与山羊抗兔（1∶500）和山羊抗鼠488（1∶500）二抗在室温下孵育3h，最后用4’，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核5min。用Leica SP2 共聚焦显微镜观察细胞并拍照。

1.8统计学方法 所有实验至少一式三份进行，数据以均数±标准差（）。利用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。用单因素方差分析确定显著性差异，然后进行Dunnett’s 事后检验。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1GEN 对CRC 细胞株增殖的影响 以CRC 细胞株（HCT-8、SW-480、HT-29 和DLD-1）和正常结肠细胞CCD-18Co 为实验对象，采用MTT 法检测GEN的抗癌作用。细胞中加入不同浓度（0、25、50、75、100、150 和200μM）的GEN，表1 显示，与0μM GEN处理组比较，50、75、100、150 和200μM 的GEN 作用24h 和48h 后，CRC 细胞增殖受到抑制，并呈剂量依赖性（P 均＜0.05），25μM 的GEN 作用48h 后SW-480 和HT-29 细胞增殖抑制（P 均＜0.05）。此外，与处理24h 组比较，SW-480 和HT-29 细胞在75、100 和150μM 的GEN 处理48h 后细胞增殖抑制（P 均＜0.05），HCT-8 细胞在100 和150μM 的GEN 处理48h 后细胞增殖抑制（P 均＜0.05），DLD-1 在100 和200μM 的GEN 处理48h 后细胞增殖抑制（P 均＜0.05）。而在200μM 浓度范围内GEN 对正常细胞CCD-18Co 无显著毒性。HCT-8、SW-480、HT-29 和DLD-1 细胞在24h 和48h 的IC50 见表2，GEN 对SW-480 细胞的IC50 最低（P＜0.05），故进一步用于确定GEN 的作用机制，选择浓度为0～150μM 的GEN 进行后续实验。

表1 栀子苷（GEN）对SW-480、HCT-8、HT-29、DLD-1 和CCD-18Co 细胞活力的影响（n=3，）

表1 栀子苷（GEN）对SW-480、HCT-8、HT-29、DLD-1 和CCD-18Co 细胞活力的影响（n=3，）

注：SW-480、HCT-8 和HT-29 为人结肠癌细胞；DLD-1 为人结直肠腺癌上皮细胞；CCD-18Co 为人结肠组织细胞；与0μM GEN 处理组比较，aP<0.05；与处理24h 组比较，bP<0.05

表2 SW-480、HCT-8、HT-29 和DLD-1 24 和48h半数抑制浓度（IC50）（n=3，）

表2 SW-480、HCT-8、HT-29 和DLD-1 24 和48h半数抑制浓度（IC50）（n=3，）

注：SW-480、HCT-8 和HT-29 为人结肠癌细胞；DLD-1 为人结直肠腺癌上皮细胞；与SW-480 细胞比较，aP<0.05

2.2GEN 对SW-480 细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测GEN 对SW-480 细胞凋亡的影响，图1A 和表3 显示，GEN（50、100、150μM）处理48h 后，凋亡细胞百分率显著增加，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。此外，与0μM GEN 处理组比较，GEN 处理可以显著增加凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2 表达（P＜0.05），见图1B和表4。

2.3GEN 对SW-480 细胞周期的影响 GEN（100和150μM）作用48h 后，SW-480 细胞周期阻滞于G2-M 期（P＜0.05，见图1C 和表3），细胞周期蛋白cyclin B1 表达下降（P＜0.05，见图1D 和表4）。

图1 栀子苷（GEN）对SW-480 细胞凋亡和细胞周期的影响

表3 栀子苷（GEN）对SW-480 细胞凋亡和细胞周期的影响（n=3，）

表3 栀子苷（GEN）对SW-480 细胞凋亡和细胞周期的影响（n=3，）

注：人结肠癌细胞SW-480 经不同浓度（0、50、100 和150μM）的栀子苷（GEN）作用48h；与0μM GEN 处理组比较，aP<0.05

表4 SW480 细胞Bax/Bcl-2、cyclin B1、p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2 和p-p53/p53 相对蛋白表达水平（n=3，）

表4 SW480 细胞Bax/Bcl-2、cyclin B1、p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2 和p-p53/p53 相对蛋白表达水平（n=3，）

注：人结肠癌细胞SW-480 经不同浓度（0、50、100 和150μM）的栀子苷（GEN）作用48h；与0μM GEN 处理组比较，aP<0.05

2.4GEN 对Akt/MDM2/p53 信号通路的影响 GEN下调CRC 细胞系Akt 和MDM2 蛋白表达，并激活p53 蛋白表达（P＜0.05，见图2 和表4），为了研究GEN 对细胞增殖的抑制是否依赖于Akt 蛋白的表达，通过用含有pLKO 或shRNA-Akt1/2 的慢病毒载体感染细胞来进行Akt 的敲低（见图3A），CRC 细胞Akt1/2 的敲低导致细胞增殖减少（见图3B），而GEN处理无法进一步抑制shRNA-Akt1/2 细胞中的增殖能力（见图3C）。免疫荧光染色显示，GEN 下调CRC细胞系MDM2 表达，并激活p53，与pLKO 组比较，Akt1/2 敲低后MDM2 被抑制，而p53 被激活（见图3D）。

图2 GEN 对Akt/MDM2/p53 信号通路的影响

3 讨论

药用植物天然产物具有高效低毒的特点，GEN是栀子的主要生物活性成分之一，具有抗炎和抗肿瘤等重要的治疗作用。此外，GEN 有效发挥胃肠疾病保护剂的作用[8]，其通过抑制炎症和黏膜损伤减轻结肠炎[9]，研究证明，GEN 可以预防和治疗炎症驱动的疾病，包括癌症[6，10]。据报道，GEN 能抑制癌细胞增殖和促进其凋亡，从而发挥抗肿瘤作用[7]。在胃癌中，GEN 治疗也对癌细胞的恶性生物学行为具有抑制作用[11]。在此基础上，本研究发现GEN 可抑制CRC 细胞的增殖，而对Ccd-18Co 细胞的生长无明显影响。这与之前的研究一致，提示GEN 的抗肿瘤活性，但对正常细胞无毒且安全[7]。此外，我们发现GEN 可诱导CRC 细胞发生G2/M 期阻滞和凋亡。已有研究报道，GEN 对弥漫性大B 细胞淋巴瘤细胞的增殖和凋亡抵抗具有抑制作用[12]。然而，尚不清楚GEN 如何参与CRC 中细胞增殖和凋亡的调节。

Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也称为蛋白激酶B（PKB），其抑制细胞凋亡，调节糖原代谢，促进癌症进展，磷酸化Akt 的过表达是恶性肿瘤治疗的一个靶点[13]。以往的研究表明，Akt/MDM2/p53 信号通路对细胞凋亡有相当大的影响，并与肿瘤的发生发展有关[14]。本研究中GEN 抑制CRC 细胞Akt/MDM2/p53 信号通路。据报道，Akt 信号通路的异常激活与CRC 的进展密切相关，尽管一些Akt 抑制剂已经用于治疗CRC，然而Akt 作为CRC 靶点的报道很少。本研究中，Akt 敲低显著抑制CRC 细胞的生长，这与之前的报告一致[15]。此外，p53 在多细胞生物体中扮演着重要的肿瘤抑制因子的角色，在癌症发展和其功能障碍可能有助于快速细胞增殖和减少DNA 修复能力[16]。本研究还证明，GEN 可以增加p53 和Bax蛋白的表达，并降低Bcl-2 蛋白的表达。

据报道，AKT 磷酸化可以促进转录因子MDM2的稳定和核易位，从而引发随后的肿瘤抑制因子p53的泛素化和降解[17]。本研究中Akt1/2 基因敲除抑制MDM2 和p53 表达。因此，GEN 可能通过抑制Akt 介导的MDM2 磷酸化来激活p53 介导的通路，从而有助于抑制CRC 细胞增殖和促进细胞凋亡。

综上所述，GEN 抑制CRC 细胞增殖和诱导G2/M 期阻滞和凋亡，其作用机制可能通过Akt/MDM2/p53 途径，从而发挥抗癌作用，即GEN 抑制Akt 介导的MDM2 和p53 激活，从而抑制人CRC 细胞的增殖。但是目前研究尚缺乏在生物体内的验证，希望能在后续研究中增加体内实验，以充分评估GEN 对生物体的安全性和治疗有效性。