miR-146a多态性与糖尿病周围神经病变及临床疗效的相关性研究

张馨允, 王泽华, 姚思宇

(开滦总医院 内分泌科, 河北 唐山, 063000)

糖尿病为临床常见的慢性疾病，随着中国居民经济水平的提高和生活方式的改变，近年来其发病率呈上升趋势[1]。糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病最常见和最复杂的慢性并发症之一，容易造成神经结构改变及功能障碍，引起麻痛、发凉、感觉减退等临床症状[2]。2型糖尿病(T2DM)患者的DPN患病率为42.2%, 高于1型糖尿病患者[3], 且随着病情恶化最终可导致足部溃疡、坏疽，甚至有截肢致残的风险[4]。DPN是多种因素协同作用的结果，确切的发病机制尚未完全阐明，其中遗传易感性是DPN的发病基础。微小RNA(miRNA)是一类由19～25个核苷酸组成的非编码RNA, 广泛存在于动植物中，人类基因组中有20%～30%受miRNA调控。miR-146为多功能非编码小分子RNA, 是参与天然免疫的调控因子，主要通过对核转录因子-κB(NF-κB)相关通路的靶基因进行调控而影响细胞代谢，特别是影响炎症反应的进程[5]。T2DM患者外周血miR-146a水平较健康者普遍降低[6]，而miR-146a表达降低与T2DM的易感性有关[7]。miR-146a可通过作用于靶基因白介素受体相关激酶1(IRAK-1)和肿瘤坏死因子相关受体6(TRAF-6), 调控NF-κB通路参与DPN的发生发展[8]。编码miRNA基因的单核苷酸多态性(SNP)可通过影响初级转录产物影响pre-miRNA及其加工过程，改变蛋白质表达，从而参与各种疾病的发生发展。目前, miR-146a基因多态性的报道多集中于自身免疫性疾病和癌症方面，关于其与DPN相关性的研究则相对较少。本研究探讨了miR-146a基因多态性与DPN易感性和临床疗效的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月—2020年12月在开滦总医院内分泌科就诊的524例T2DM患者作为研究对象，均符合1999年世界卫生组织(WHO)提出的糖尿病诊断标准[9]。将299例单纯糖尿病患者纳入单纯T2DM组，将225例T2DM合并DPN患者纳入DPN组。DPN组患者纳入标准: ① 年龄≥18周岁者; ② 临床诊断符合《糖尿病防治指南(2017版)》中DPN诊断标准[10]者; ③ 未合并其他严重疾病者。排除标准: ① 并发其他神经病变(如颈腰椎病变、中毒性末梢神经炎、感染性多发性神经炎、骨关节炎、脑卒中、格林巴利综合征等)者; ② 并发其他对神经传导产生影响的疾病(如慢性酒精中毒、药物等)者; ③ 存在心脏、肝脏、肾脏功能严重障碍者; ④ 存在严重动静脉血管性疾病(如静脉栓塞、淋巴管炎等)者; ⑤ 合并恶性肿瘤、免疫系统或全身炎症疾病者; ⑥ 哺乳期或妊娠期妇女; ⑦ 对治疗药物过敏者。本研究经过医院伦理委员会审核批准，且患者均签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 资料收集: 收集所有患者的年龄、性别、糖尿病病程、身高、体质量等临床资料，并计算体质量指数(BMI)。

1.2.2 实验室指标检测: 清晨抽取所有患者空腹静脉血5 mL置于普通采血管，室温下静置30 min, 待血液完全凝固后于高速低温离心机上以3 500 转/min离心15 min, 分离得血清。应用美国Roche公司7200-C全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平，应用美国Roche公司全自动化学发光免疫分析仪检测空腹胰岛素(FINS)水平。另取患者空腹静脉血2 mL于抗凝管，采用高效液相离子层析法检测糖化血红蛋白(HbA1c)水平。计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR), HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.2.3 miR-146a 基因多态性检测: 清晨抽取所有患者空腹静脉血1 mL置于EDTA抗凝管，采用天根生化科技(北京)公司血液全基因组DNA提取试剂盒提取DNA。MiR-146a基因引物和探针序列由天根生化科技(北京)公司合成。MiR-146a基因上游引物和下游引物分别为5′-GAACTGAATTCCATGGGTTGTGT-3′和5′-GCCCACGATGACAGAGATATCC-3′, 探针G allele序列为5′-FAM-TCAGACCTGTGAAATT-MGB-3′, 探针C allele序列为5′-HEX-TCAGACCTCTGAAATT-MGB-3′。应用Applied Bioststems公司的7500实时聚合酶链反应(PCR)系统对目的片段扩增及检测基因型。PCR反应条件: 50 ℃预热2 min, 95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性15 s, 60 ℃ 退火40 s, 共55 个循环。采用双盲法判断TaqMan分型结果。

1.2.4 治疗方法: 所有患者均按《糖尿病防治指南(2017版)》进行糖尿病饮食及运动干预，同时口服降糖药控制血糖[目标为FPG<7.0 mmol/L, 餐后2 h血糖(2 hPG)<10.0 mmol/L]。DPN患者同时服用依帕司他片(50 mg/次，3次/d)和甲钴胺片(0.5 mg/次，3次/d)，疗程为3个月。

1.3 临床疗效评价

治疗前后采用丹麦DNA TEC公司OISA 2000型肌电图仪检测DPN患者腓总神经、尺神经、胫神经、正中神经的运动神经和感觉神经传导速度，各指标重复检测3次，最后结果取平均值。采用多伦多临床评分系统(TCSS)[11]评估DPN患者的临床症状与体征，由专人登记每例患者治疗前后各相关指标的数据并汇总分析。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 临床资料比较

DPN组糖尿病病程长于单纯T2DM组, FPG、HbA1c、FINS和HOMA-IR水平高于单纯T2DM组，差异有统计学意义(P<0.05); 2组患者的性别、年龄和BMI、TG、TC、LDL、HDL水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组患者临床资料比较

2.2 miR-146a基因型和等位基因分布频率比较

2组miR-146a基因型及等位基因分布频率比较，差异有统计学意义(P<0.05); DPN组患者GG基因型分布频率高于单纯T2DM组, CG基因型分布频率低于T2DM组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者miR-146a基因型及等位基因分布频率比较[n(%)]

等位基因百分率以每组各等位基因出现总频次计算。

2.3 DPN患病风险的多因素分析

二分类Logistic回归分析显示，糖尿病病程、FPG、HbA1c、HOMA-IR和miR-146a基因分型均为T2DM患者发生DPN的独立影响因素(P<0.05)。见表3。

表3 T2DM患者发生DPN风险的多因素分析

2.4 miR-146a基因多态性与DPN患病风险分析

GG基因型患者的DPN患病风险高于CC基因型患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组患者miR-146a不同基因型比较[n(%)]

2.5 DPN患者的临床治疗效果

治疗3个月后, DPN患者腓总神经、尺神经、胫神经和正中神经的运动和感觉神经传导速度均高于治疗前, TCSS评分低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 225例DPN患者治疗前后TCSS评分和运动感觉神经传导速度比较

2.6 DPN患者临床疗效与miR-146a基因多态性的相关性分析

治疗前, miR-146a不同基因型DPN患者的TCSS评分、运动感觉神经传导速度比较，差异均无统计学意义(P>0.05); 治疗3个月后, GG基因型患者运动感觉神经传导速度低于CC基因型和CG基因型患者, TCSS评分高于CC基因型和CG基因型患者，差异有统计学意义(P<0.05); 治疗3个月后, CG基因型患者运动感觉神经传导速度低于CC基因型患者, TCSS评分高于CC基因型患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 miR-146a不同基因型DPN患者治疗前后运动感觉神经传导速度和TCSS评分比较

3 讨 论

糖尿病患者可能发生严重的慢性并发症，其中DPN为糖尿病最常见的并发症之一，长期高血糖状态可导致周围神经细胞供给紊乱，最终诱发周围神经病变。研究[12]表明, DPN发病机制较复杂，可能是多种因素共同作用的结果，以遗传易感性为基础、糖脂代谢紊乱引起固有性免疫的长期慢性激活而导致慢性炎症反应。早期发现和治疗是延缓病情进展的重要措施，DPN早期表现不典型，临床难以早期诊断，故如何有效筛选高危人群并及时干预是临床关注的热点。本研究结果显示，糖尿病病程、FPG、HbA1C和HOMA-IR均为T2DM患者发生DPN的独立影响因素(P<0.05), 提示临床应重点关注上述因素，必要时尽量控制，以延迟DPN的发生。

miRNA在多种人类疾病中发挥着重要作用，在临床上常被用作诊断标志物或基因治疗靶点。miR-146a基因位于人类5号LOC285628基因的第2个外显子上(Chr. 5q34), 存在1个rs编码为2910164的pre-miR-146a C/G变异，在炎症、肿瘤、自身免疫性疾病等疾病中发挥着重要作用[13]。国外研究[14-15]结果显示, miR-146a rs2910164是印度南部人群DPN的易感基因, CC基因型和C等位基因与T2DM患病风险增加相关。另有研究[16]显示，高加索人miR-146a基因多态性与DPN相关。王国凤等[17]研究显示, miR-146a基因多态性是糖尿病患者发生DPN的危险因素。本研究结果显示, DPN组患者GG基因型分布频率高于单纯T2DM组, CG基因型分布频率低于T2DM组，且GG基因型患者的DPN患病风险高于CC基因型患者，差异均有统计学意义(P<0.05), 因此GG基因型是DPN发病的危险因素，与上述研究结论基本一致。

DPN的临床治疗比较棘手，目前尚缺乏特效治疗手段，以控制血糖、营养神经等对症支持治疗为主，但仅可以改善相关症状及体征。甲钴胺是一种内源性辅酶B12，可修复受损的神经细胞，改善神经代谢及传导[18]; 依帕司他可抑制醛糖还原酶活性，抑制多元醇通路的激活而减轻氧化应激反应，控制细胞炎性反应与程序性死亡，从而修复神经组织损伤[2]。本研究中, DPN患者接受甲钴胺联合依帕司他治疗3个月后，腓总神经、尺神经、胫神经和正中神经的运动和感觉神经传导速度均高于治疗前, TCSS评分均低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05), 说明甲钴胺联合依帕司对DPN有较好的治疗效果。王国凤等[19]研究显示, CC基因型DPN患者治疗后的临床有效率和神经传导速度增加幅度显著高于GG基因型患者。本研究中，接受甲钴胺联合依帕司他治疗3个月后, GG基因型患者运动感觉神经传导速度低于CC基因型和CG基因型患者, TCSS评分高于CC基因型和CG基因型患者，差异有统计学意义(P<0.05), 说明miR-146基因多态性对甲钴胺联合依帕司他治疗DPN的临床效果具有一定影响。

综上所述, miR-146a基因多态性与T2DM患者DNP易感性及临床治疗效果有关, GG基因型T2DM患者的DNP易感性较高且临床疗效较差。