LncRNA TBX5-AS1靶向miR-92a-3p调控结直肠癌HCT116细胞增殖、迁移及侵袭的机制研究

周庆全, 徐 飞, 刘浩燕, 王宗站

(山东省青岛市中心医院, 1. 结直肠肛门外科, 2. 放疗一科, 山东 青岛, 266000)

结直肠癌是中国常见的恶性肿瘤，其发病率与病死率逐年增高，结直肠癌细胞增殖及转移是造成患者预后不良的重要原因。长链非编码RNA(LncRNA)在结直肠癌发生及发展过程中发挥重要的调控作用，可通过调控微小RNA(miRNA)发挥作用[1-4]。LncRNA T-box转录因子5反义RNA 1(TBX5-AS1)在非小细胞肺癌组织与细胞系中表达下调，上调其表达可抑制细胞增殖、迁移及侵袭，并可促进细胞凋亡[5]。但TBX5-AS1在结直肠癌中的表达及其作用机制尚未可知。LncBase Predicted v. 2预测软件显示TBX5-AS1与miR-92a-3p存在结合位点，研究[6]表明miR-92a在结直肠癌细胞中表达上调，并可促进细胞增殖及转移。但TBX5-AS1与miR-92a-3p在结直肠癌发生及发展过程中的作用机制尚未阐明。本研究探讨TBX5-AS1是否可通过调控miR-92a-3p而调节结直肠癌细胞生物学行为，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集2019年1月—2020年8月在本院接受手术治疗的37例结直肠癌患者的结直肠癌组织及相应癌旁组织，其中男20例，女17例，年龄52～71岁，平均(63.26±7.44)岁。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。材料与试剂包括: 人结直肠癌细胞HCT116购自上海弘顺生物; DMEM培养基、胎牛血清、Lipofectamine2000、Trizol试剂购自美国Thermo Fisher; 逆转录试剂与SYBR Green qPCR MasterMix试剂购自北京天根生化科技公司; miR-NC、miR-92a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-92a-3p、pcDNA、pcDNA-TBX5-AS1购自上海吉玛; MTT、Transwell小室、Matrigel基质胶购自北京索莱宝; Dual-Luciferase Reporter Assay Kit试剂购自美国Promega; 兔抗人E-cadherin、N-cadherin、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抗体与二抗购自美国Abcam。StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI; 酶标仪、电泳仪与凝胶成像系统购自美国Thermo Fisher; 离心机与电泳槽购自北京六一生物。

1.2 方法

1.2.1 实验分组: 取HCT116细胞(1×105个/mL)接种于6孔板(200 μL/孔)，采用Lipofectamine2000转染试剂分别将pcDNA、pcDNA-TBX5-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-92a-3p、miR-NC、miR-92a-3p mmics、pcDNA-TBX5-AS1与miR-92a-3p mmics转染至HCT116细胞，分别记为pcDNA组、pcDNA-TBX5-AS1组、anti-miR-NC组、anti-miR-92a-3p组、miR-NC组、miR-92a-3p组、pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p组。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测TBX5-AS1、miR-92a-3p的表达水平: 采用Trizol试剂分别提取结直肠癌组织、癌旁组织和各组HCT116细胞总RNA, 逆转录合成cDNA，按照SYBR Green qPCR MasterMix试剂说明书对TBX5-AS1、miR-92a-3p的表达量进行检测, TBX5-AS1以GAPDH为内参,miR-92a-3p以U6为内参。反应体系: SYBR Green Mix 10.0 μL, cDNA 2.0 μL, 上下游引物各0.5 μL, RNase-Free ddH2O补足体系至20.0 μL; 反应条件: 95℃预变性2 min, 95 ℃变性30 s, 59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40次循环，用2-ΔΔCt法计算TBX5-AS1、miR-92a-3p相对表达量。

1.2.3 MTT检测细胞增殖: 取对数生长期HCT116细胞接种于96孔板(5×103个/孔)，按照1.2.1方法分组处理后，分别在培养24、48、72 h时向每孔加入20.0 μL MTT溶液，于37 ℃培养箱内继续培养4 h后，弃上清，每孔加入150.0 μL二甲基亚砜(DMSO), 室温避光振荡孵育5 min, 应用酶标仪检测各孔吸光度值。

1.2.4 平板克隆形成实验: 取各组HCT116细胞接种于6孔板，密度为每孔1×104个细胞，每隔2 d更换1次培养液，直至细胞出现肉眼可见的克隆时终止培养，加入4%多聚甲醛固定15 min后进行结晶紫染色5 min, PBS洗涤后晾干，观察克隆形成细胞数。

1.2.5 划痕实验: 实验前采用记号笔在6孔板后面每隔0.5 cm划横线，各组HCT116细胞培养至对数期后按照每孔1×105个接种于6孔板，于37 ℃培养箱内培养24 h, 待细胞铺满后采用20.0 μL移液枪的枪头垂直于横线划痕, PBS洗涤后加入不含胎牛血清的培养基，于200倍镜下拍照记录0 h时划痕位置与宽度，于培养箱内继续培养24 h后于200倍镜下拍照记录，检测细胞迁移距离。

1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭: 取各组HCT116细胞用胰蛋白酶消化后吹打混匀, 1 000 转/min离心3 min后，加入不含胎牛血清的培养基重悬细胞(2×104个/mL), 取200.0 μL细胞悬液接种于平铺Matrigel基质胶的上室，下室加入含有10%胎牛血清的培养基，于37 ℃培养箱内培养24 h后采用PBS洗涤，多聚甲醛固定20 min, 0.1%结晶紫染液染色10 min, 200倍显微镜下观察并计算穿膜细胞数。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测TBX5-AS1和miR-92a-3p的靶向关系: 根据靶基因预测软件预测TBX5-AS1和miR-92a-3p可能的结合位点，体外合成该位点的DNA片段(wt-TBX5-AS1)及包含该位点突变体的DNA片段(mut-TBX5-AS1), 将其克隆至双荧光素酶启动子载体PGL3, 将报告质粒分别与miR-NC或miR-92a-3p mimics共转染至HCT116细胞中，培养48 h后采用试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.8 Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达: 转染后各组HCT116细胞采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入10%SDS-PAGE分离蛋白，凝胶电泳时电压80 V, 电流调整至最大，恒压条件下跑胶2.5 h, 采用电转法将蛋白转移至PVDF膜，电流调整至最大，电压80 V转膜1 h, PVDF膜转移至5%脱脂奶粉中封闭1 h, 向其中加入1∶1 000稀释的E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、GAPDH, 于4 ℃孵育24 h, TBST洗涤，加入1∶5 000稀释的二抗，室温封闭1 h, 加入ECL化学发光液，采用Image J软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 TBX5-AS1和miR-92a-3p表达的检测

与癌旁组织比较，结直肠癌组织中TBX5-AS1的表达量降低, miR-92a-3p的表达量升高; 与pcDNA组比较, pcDNA-TBX5-AS1组TBX5-AS1的表达量升高, miR-92a-3p的表达量降低; 与anti-miR-NC组比较, anti-miR-92a-3p组miR-92a-3p的表达量降低; 与miR-NC组比较, miR-92a-3p组miR-92a-3p的表达量升高; 与pcDNA-TBX5-AS1组比较, pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p组miR-92a-3p的表达量升高; 上述组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A: TBX5-AS1在结直肠癌组织(n=37)中的表达,与癌旁组织比较, ∗P<0.05; B: miR-92a-3p在结直肠癌组织(n=37)中的表达,与癌旁组织比较, ∗P<0.05; C: TBX5-AS1在结直肠癌细胞中的表达,与HIEC-6比较, ∗P<0.05; D: miR-92a-3p在结直肠癌细胞中的表达,与HIEC-6比较, ∗P<0.05; E: 干扰TBX5-AS1处理后TBX5-AS1的表达,与pcDNA比较, ∗P<0.05; F: 各个处理组细胞中miR-92a-3p的表达,与pcDNA比较, ∗P<0.05, 与anti-miR-NC比较, #P<0.05, 与miR-NC比较, △P<0.05, 与pcDNA-TBX5-AS1比较, ▲P<0.05。图1 TBX5-AS1和miR-92a-3p的表达

2.2 MTT法和克隆形成实验检测各个处理组对HCT116增殖的影响

与pcDNA组比较, pcDNA-TBX5-AS1组细胞存活率降低，克隆形成数减少，差异有统计学意义(P<0.05); 与anti-miR-NC组比较, anti-miR-92a-3p组细胞存活率降低，克隆形成数减少; 与miR-NC组比较, miR-92a-3p组细胞存活率升高，克隆形成数增多; 与pcDNA-TBX5-AS1组比较, pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p组细胞存活率升高，克隆形成数增多; 上述组间差异均有统计学意义(P<0.05), 见图2、表1。

图2 各个处理组对HCT116克隆形成的影响

表1 各个处理组对HCT116克隆形成的检测

2.3 划痕实验和Transwell实验检测各个处理组对HCT116迁移、侵袭的影响

与pcDNA组比较, pcDNA-TBX5-AS1组迁移距离缩短，侵袭细胞数减少; 与anti-miR-NC组比较, anti-miR-92a-3p组迁移距离缩短，侵袭细胞数减少; 与miR-NC组比较, miR-92a-3p组迁移距离增加，侵袭细胞数增多; 与pcDNA-TBX5-AS1组比较, pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p组迁移距离增加，侵袭细胞数增多; 上述组间差异均有统计学意义(P<0.05), 见图3、图4及表2。

图3 各个处理组对HCT116迁移的影响

图4 各个处理组对HCT116侵袭的影响

表2 各个处理组对HCT116迁移距离和侵袭细胞数的结果比较

2.4 双荧光素酶报告实验检测TBX5-AS1和miR-92a-3p靶向关系

TBX5-AS1和miR-92a-3p存在结合位点，见图5。共转染wt-TBX5-AS1的细胞实验中，与miR-NC组比较, miR-92a-3p组荧光素酶活性降低，差异有统计学意义(P<0.05); 共转染mut-TBX5-AS1的细胞实验中, miR-92a-3p组与miR-NC组荧光素酶活性比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表3。

图5 TBX5-AS1和miR-92a-3p的互补序列

表3 双荧光素酶报告实验结果

2.5 Western检测各个处理组对HCT116中蛋白的表达

与pcDNA组比较, pcDNA-TBX5-AS1组E-cadherin蛋白表达量升高, N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达量降低; 与anti-miR-NC组比较, anti-miR-92a-3p组E-cadherin蛋白表达量升高, N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达量降低; 与miR-NC组比较, miR-92a-3p组E-cadherin蛋白表达量降低, N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达量升高; 与pcDNA-TBX5-AS1组比较, pcDNA-TBX5-AS1+miR-92a-3p组E-cadherin蛋白表达量降低, N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达量升高; 上述组间差异均有统计学意义(P<0.05), 见图6、表4。

图6 不同处理组E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达比较

表4 各个处理组对HCT116中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达结果比较

3 讨 论

结直肠癌具有发病率高、病死率高等特点, LncRNA包含保守序列，其调控基因表达的方式具有多样性，主要是参与转录调控与转录后调控等过程，进而在肿瘤发生发展过程中发挥重要的调控作用，如LncRNA MAFG-AS1通过充当miR-147b的竞争性内源RNA(ceRNA)而激活NDUFA4, 进而促进结直肠癌的发展[7]。LncRNA-SNHG15通过抑制miR-338-3p而促进结直肠癌细胞增殖[8]。LncRNA BDNF-AS通过抑制GSK-3beta表达而抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移[9]。LncRNA NBR2通过下调miR-21而抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭[10]。

TBX5-AS1在肺癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌等肿瘤中表达异常，其表达量与患者预后不良有关[11-13]。本研究结果显示，结直肠癌组织中TBX5-AS1的表达量低于癌旁组织, TBX5-AS1过表达可降低结直肠癌细胞活力，减少细胞克隆形成数，提示TBX5-AS1过表达可抑制结直肠癌细胞增殖及克隆形成。E-cadherin与N-cadherin是上皮-间质转化(EMT)相关蛋白，其中E-cadherin表达失调可促进细胞向间质转化，进而促进细胞转移，而N-cadherin表达下调可抑制EMT转化[14-15]。本研究结果显示, TBX5-AS1过表达后结直肠癌细胞迁移距离缩短，侵袭细胞数减少，并可促进E-cadherin表达而抑制N-cadherin表达，提示TBX5-AS1过表达可抑制结直肠癌细胞迁移及侵袭。

本研究证实结直肠癌细胞中TBX5-AS1可靶向结合miR-92a-3p, 并可负向调控miR-92a-3p的表达。研究[16]表明miR-92a-3p通过靶向KLF2促进胃癌细胞增殖和侵袭。miR-92a-3p通过调节PTEN促进食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭[17]。miR-92a-3p通过靶向FBXW7而促进前列腺癌细胞增殖及迁移[18]。本研究结果显示，结直肠癌组织中miR-92a-3p的表达量高于癌旁组织，抑制miR-92a-3p表达能够抑制结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭，而miR-92a-3p过表达可明显促进结直肠癌细胞增殖及增强细胞克隆形成、迁移、侵袭能力，还可进一步逆转TBX5-AS1过表达对结直肠癌细胞生物学行为的作用，提示TBX5-AS1可通过靶向调控miR-92a-3p而调节结直肠癌细胞生物学行为。

综上所述，结直肠癌组织中TBX5-AS1的表达量降低, miR-92a-3p的表达量升高, TBX5-AS1过表达可通过靶向调控miR-92a-3p的表达而抑制结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭, TBX5-AS1或可作为结直肠癌的潜在治疗靶点。