布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠脂质水平、肝功能、血液流变学及肝脏病理形态的影响

黄雪君 杨九妹 毕晓黎 蔡大可 甘海宁 陈玉兴

随着代谢性疾病患病率的增加，非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成为最常见慢性肝病之一。肥胖、糖尿病和血脂代谢异常是最危险因素[1-2]。NAFLD的全球患病率约为25%，预计2030年将达到 28.4%[3]。NAFLD有可能进展为非酒精脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝细胞癌。中医认为脾虚肝郁，痰浊瘀滞为非酒精性脂肪肝的主要病因病机，古代经方及临床验方等均在治疗NAFLD取得较好的治疗效果。李金生认为由于痰阻、血瘀及气滞单个或多个相互为患，诱发气滞脂停，久则形成脂肪肝，临床治以健脾疏肝降脂汤加减[4]。参苓白术散对mTORC1、STAT3 相关基因的抑制，改善肝脏炎性反应及脂肪蓄积[5]。柴胡疏肝散通过调节胰岛素信号通路InsR-β、FOXO1A 的表达，改善肝郁气滞型脂肪肝模型大鼠脂代谢[6]。茵陈苓桂剂可调节血脂和肝酶，保护肝功能，起到防治非酒精性脂肪肝病的作用[7]。单味中药及提取物[8-9]亦作用于不同靶点对非酒精性脂肪肝起一定作用，荷叶、青蒿、蒲公英等提取物，通过调节HIF-1α/PPARγ、MAPK、AMPK等通路，改善血脂水平、炎症反应及胰岛素抵抗，防止肝组织脂肪化。

布芍调脂胶囊(BushaoTiaozhiCapsule，BSTZC)，是由布渣叶、赤芍、莪术、穿心莲组成的中药六类新药，主治高脂血症之气滞血瘀或兼有痰浊湿热。该新药已获临床试验批件(2016L02809)，目前正开展Ⅱ期临床试验研究。课题组前期研究发现其对降低肝脏脂质水平有一定作用，因此，本研究将观察布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠模型的影响，初步探讨其对非酒精性脂肪肝的保护作用，为临床应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

阿托伐他汀钙片(辉瑞有限公司，批号：CF2681)；布芍调脂胶囊(国药集团环球制药有限公司生产，批号：20191012)胆固醇 (total cholesterol, TC) 试剂盒，甘油三酯(triglyceride, TG) 试剂盒，低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C) 试剂盒，高密度脂蛋白 (high density lipoprotein cholesterol, HDL-C) 试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所，批号为：20191119、20191119、20200227、20200227；丙 氨 酸 氨基 转 移 酶 (alanine a minotransferase，ALT)测定试剂盒，天门冬氨酸氨基转移酶(alanine a minotransferase，AST)测定试剂盒，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒测定试剂盒，均购自广州科方生物技术股份有限公司，批号为：200521、200521、200406。

1.2 动物与饲料

SPF级SD大鼠48只，雌雄各半，6～8周龄，体质量180～220 g，分6组，每组8只。实验动物质量合格证号：44007200072612。购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK (粤)2018-0002，动物实验环境：广东省中医药工程技术研究院SPF级动物实验室，设施使用许可证号SYXK(粤)2015-0059。大鼠高脂饲料, 购自广东省医学实验动物中心，批号：20191105。

1.3 仪器

BS224S电子天平(1/万)，德国Sartorius公司； 5418型小型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；全自动血流变学分析仪，北京普利生仪器有限公司；7010生化分析仪，日本日立公司；Varioskan Flash型全波长多功能酶标仪，美国Thermo公司；BX51型荧光显微镜，日本奥林巴斯株式会社。

1.4 造模与给药

48只大鼠适应性喂养一周后，随机分为正常组、模型组、阿托伐他汀组(1.8 mg/kg)，布芍调脂胶囊高剂量组(5.76 g生药/kg)、布芍调脂胶囊中剂量组(2.88 g生药/kg)及布芍调脂胶囊低剂量组(1.44 g生药/kg)，每组各8只，正常组定量给予普通饲料，其余组定量给予高脂饲料(蔗糖20%、猪油15%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、酪蛋白10%、磷酸氢钙0.6%、石粉0.4%、预混料0.4%、基础饲料52.2%)，连续8周。各给药组每天按剂量给予相应药物灌胃，给药剂量按临床用量根据体表面积折算[10]，正常组、模型组同法给予等体积蒸馏水灌胃，每天1次，连续4周。给药期间，各组大鼠造模方法同前述。

1.5 标本采集

末次给药前12小时禁食不禁水。末次给药后1小时，记录大鼠体重，将大鼠麻醉后腹主动脉取血，3000 rpm离心10分钟，取血清用于生化检测，另肝素抗凝用于血液流变学检测；取出肝脏大体观察及称重后，一部分-80℃保存用于检测肝脏脂质水平，另一部分置于中性甲醛溶液固定作病理检查。

1.6 指标检测

肝脏病理形态检测：将用中性甲醛溶液固定的肝脏，按照常规方法制作石蜡切片，分别进行HE染色和油红O染色，显微镜观察记录肝细胞形态变化。肝脏系数计算：根据大鼠体重和肝脏重量，计算肝脏系数：肝脏系数(%)=肝脏湿重/大鼠体重×100%。血脂水平的检测：根据试剂盒检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。肝脏脂质水平的检测：根据试剂盒检测肝脏中TC、TG水平。生化指标的检测：全自动生化仪测定血清中ALT、AST、SOD的含量。血液流变学分析：血流变学分析仪测量各个样品的高切全血粘度、中切全血粘度、低切全血粘度。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏解剖形态的影响

如图1所示，正常组肝脏颜色暗红，表面光滑完整，弹性好且边缘锐利。模型组肝脏颜色变淡，呈淡红色，表面颗粒感及油腻感较重，质粗糙，弹性减弱且边缘钝；与模型组比较，各给药组肝脏大部分表面颜色暗红，弹性较好，表面稍显颗粒感及油腻感，形态明显改善。

图1 各组大鼠肝脏解剖形态

2.2 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏病理形态的影响

如图2.a所示，正常组肝脏细胞形态正常，排列整齐，无空泡样病变及脂滴的产生。模型组细胞排列无序，体积增大，可见弥漫性肝细胞脂肪变性，且出现细胞空泡样病变及脂滴；与模型组比较，各给药组细胞形态明显改善，肝细胞脂肪变性程度轻，细胞排列较整齐，细胞空泡样病变及脂滴的数量明显减少。

经油红O染色后，肝脏细胞中的脂滴呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。实验结果如图2.b所示，正常组肝脏细胞排列整齐，无红色脂滴产生。模型组细胞出现大量红色脂滴，脂质浸润明显；与模型组比较，各给药组红色脂滴明显减少，脂质浸润有所改善。

2.3 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏系数的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝脏系数显著性升高(P<0.01)；与模型组比较，阿托伐他汀组大鼠肝脏系数显著性降低(P<0.01)，布芍调脂胶囊高、中、低剂量组大鼠肝脏系数显著性降低(P<0.05)，见表1。

表1 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏系数的影响

2.4 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠血脂水平的影响

与正常组比较，模型组血清TC、TG、LDL-C水平显著性升高(P<0.01)；与模型组比较，阿托伐他汀组和布芍调脂胶囊高、中、低剂量组血清TC、TG、LDL-C水平显著性降低(P<0.01)。

与正常组比较，模型组血清HDL-C水平显著性降低(P<0.01)；与模型组比较，布芍调脂胶囊高剂量组血清HDL-C水平显著性升高(P<0.01)，阿托伐他汀组血清HDL-C水平显著性升高(P<0.05)，布芍调脂胶囊低、中剂量组无显著性差异(P>0.05)，见表2。

表2 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量的影响

2.5 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏脂质水平的影响

与正常组比较，模型组肝脏TC、TG水平显著性升高(P<0.01)；与模型组比较，阿托伐他汀组和布芍调脂胶囊高、中、低剂量组肝脏TC、TG水平显著性降低(P<0.01)。见表3。

表3 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏中TC、TG含量的影响

2.6 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠生化指标的影响

与正常组比较，模型组ALT、AST水平显著性升高(P<0.01)；与模型组比较，阿托伐他汀组和布芍调脂胶囊高、中、低剂量组ALT、AST水平显著性降低(P<0.01)。

注：a.大鼠肝脏HE染色，200× b.大鼠肝脏油红O染色，200×

与正常组比较，模型组SOD水平显著性降低(P<0.01)； 与模型组比较，阿托伐他汀组SOD水平显著性升高(P<0.05)，布芍调脂胶囊高、中、低剂量组SOD水平显著性升高(P<0.01)，见表4。

表4 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠ALT,AST,SOD含量的影响

2.7 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠血液流变学的影响

与正常组比较，模型组全血黏度低、中、高切均显著性降低(P<0.01)；与模型组比较，阿托伐他汀组和布芍调脂胶囊高、中剂量组全血黏度低、中、高切显著性升高(P<0.01)，布芍调脂胶囊低剂量组全血黏度中切显著性升高(P<0.05)，布芍调脂胶囊低剂量组全血黏度高切显著性升高(P<0.01)，布芍调脂胶囊低剂量组全血黏度低切无显著性差异(P>0.05)，见表5。

表5 布芍调脂胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠血液流变学的影响

3 讨论

血脂水平和肝功能检查在临床上是脂肪肝的主要检查手段，可反映脂肪肝的进程。脂肪被机体过量摄入，超出正常范围时，其在肝脏堆积，从而转化成TG，TG水平迅速上升，形成脂肪肝[11]。实验结果表明，布芍调脂胶囊给药后，可有效降低非酒精性脂肪肝模型大鼠血液及肝脏中的TC、TG水平，同时，肝脏病理形态明显改善，肝细胞脂肪变性程度较轻，脂滴的数量明显减少，肝脏系数明显减少。

ALT、AST主要存在于肝细胞内，作为反映肝功能的两个主要指标[12]，ALT在肝细胞受损后可进入血液；如肝细胞进一步受损，会对线粒体造成威胁，AST也将进入到血液中[13]。因此，当检查中出现ALT、AST水平显著上升，说明脂肪肝加重，肝脏受损严重[14]。SOD作为自由基主要的代谢酶，能够清除超氧阴离子自由基对细胞的损害，参与在机体的氧化与抗氧化平衡。在本实验中，布芍调脂胶囊能明显下调非酒精性脂肪肝模型大鼠的血清ALT、AST，提高SOD含量，具有保护肝功能及抗氧化的能力。

血液流变学是研究血液的流动性和形变规律，可反映血液粘度与凝固性的改变，与高脂血症、高血压、冠心病等心血管疾病关系密切。血中大量大分子脂蛋白吸附在红细胞和血小板上[15-16]，使膜表面的负荷减少，排斥力降低，进而提高黏附聚集力，升高血液的黏度。血液黏度升高，是血瘀形成的重要病理生理基础。实验结果表明，模型组全血粘度高切、中切、低切均显著性降低，提示非酒精性脂肪肝大鼠血液粘度增高；给予布芍调脂胶囊后，大鼠全血粘度高切、中切、低切均显著性升高，布芍调脂胶囊能降低血液粘度，具有一定的活血祛瘀作用。

中医认为，NAFLD病机主要是痰浊与血瘀，脂肪肝的发生发展与痰浊、瘀血密不可分[17-18]。在NAFLD中，“痰”及“瘀”的病理表现之一为肝脂、血脂过多，血液粘度变大，肝脏中过多的脂质会导致肝细胞脂肪变性，进而引起肝脏损伤。布芍调脂胶囊具有消食化痰、活血祛瘀功效，其能有效降低血清及肝脏脂质水平，保护肝功能，同时改善血液粘度，对脂肪肝起到较好的治疗作用。布芍调脂胶囊是多靶点作用于脂质代谢，在今后研究中，可针对糖脂代谢相关指标及信号通路进行研究，以进一步阐明布芍调脂胶囊治疗NAFLD 的作用机制。