退热六法对脂多糖致热兔toll样受体4/核转录因子-κB及炎症因子的影响

焦谊 刘志凤 于天源 张英琦 刘迪 王厚融 徐亚静 官乾

发热作为儿科常见的症状之一，发生率为25.7%，每人每年约0.8次[1]。长期发热或体温过高则会损害机体调节功能，使病情恶化。小儿推拿退热具有安全性和有效性[2]，其中以开天门[3]138、推坎宫[3]138、揉太阳[3]138-139、揉耳后高骨[3]151、清天河水[4]、推脊[5]手法最为常用，现有小儿推拿退热研究不深入，受到社会质疑。故选取脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)模型模拟临床细菌性发热，LPS作为toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)公认的配体，能刺激机体产生炎症反应，核转录因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)参与机体免疫调节、炎症反应、感染、细胞周期调控、细胞分化及凋亡等[6]，发热过程以炎症介质如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)最为重要，故以退热六法为例，设计实验进行深入研究。

1 材料及方法

1.1 实验动物

清洁级2月龄新西兰幼兔24只，体质量(2000±200)g，肛温(39.00±0.50)℃，雌雄各半，购自北京隆安实验动物养殖中心[合格证号为SCXK(京)2019-0006]。饲养于北京中医药大学动物实验室，温度(25±0.5)℃，相对湿度(65±5)%，12小时/12小时明暗周期，自由饮食饮水。适应性饲养3天，排除肛温波动大于0.4℃的新西兰兔。实验程序经北京中医药大学动物使用和管理委员会批准，符合动物福利与伦理原则。

1.2 仪器及试剂

主要试剂：大肠杆菌内毒素脂多糖(美国Sigma公司；批号：055：B5 L2880)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司；批号：PC0020)；TLR4抗体(批号：bs-20594R)、NF-κB p65抗体(批号：bs-0465R)、GAPDH抗体(批号：bsm-0978M)以上试剂均购自北京奥博森生物科技有限公司。

主要仪器： ChemiDoc MP成像仪(美国BIO-RAD公司)；MultiSkan3酶标仪(美国THERMO公司)；BL-420N(成都泰盟软件有限公司)、动物五分类血细胞分析仪(优利特URIT-5160Vet)。

1.3 动物分组及模型制备

将24只新西兰兔随机分为正常组8只、模型组8只、推拿组8只。清醒状态下，模型组和推拿组幼兔耳缘静脉注射浓度为0.5 μg/mL LPS，注射量为1 mL/kg[7-8]，注射后1小时内肛温上升超过0.6 ℃为造模成功，正常组不予处理。

1.4 干预方法

正常组和模型组正常饲养。推拿组：造模后1小时干预1次。(1)开天门：定位：两眉骨内侧中点至神庭穴(前正中线，额顶骨缝交界处)[9]，操作：用拇指自下而上交替直推200次，2分钟[10]；(2)推坎宫：定位：精明穴(内眼角，上下眼睑交界处)直上至丝竹空穴(眶上突外端)[9]，操作：用两拇指桡侧自眉心向眉梢做分推200次，2分钟[10]；(3)揉太阳：定位：太阳穴(外眼角后上方颞窝中)[9]，操作：用两拇指桡侧推运200次，2分钟[10]；(4)揉耳后高骨：定位：寰椎翼前缘直上方凹陷处[9]，操作：用两拇指或中指端揉24次掐3下，2分钟[10]；(5)推脊：定位：大椎穴(背中线上，第7颈椎与第1胸椎棘突间)至尾根[9]，操作：用食中二指自上而下直推300次，5分钟[10]。(6)清天河水：定位：腕横纹至肘横纹[9]，操作：用食中指指面自腕推向肘，推500次，5分钟[11]。操作要点：由推拿学科专业人员操作，且都为同一人干预，操作时蘸取与室温相同的温水。

1.5 取材及指标检测

1.5.1 肛温监测 采用BL-420N监测肛温变化。肛温探头涂上适量石蜡油，插入肛门固定为5 cm，待稳定后读数，作为幼兔的肛温，之后每隔30分钟记录一次肛温，连续监测6小时。体反应指数(total response index,TRI)：按梯形法计算造模后2小时、3小时、4小时、5小时、6小时的曲线下面积(TRI2-6)，横坐标0.5小时为1 cm，纵坐标0.5 ℃为1 cm。

1.5.2 中性粒细胞比率检测 于造模前、造模后1小时、造模后3小时(即推拿后2小时)耳缘静脉采血，用EDTA抗凝管采取0.5 mL即可，抽取完毕后轻轻摇匀4～5次，避免凝血。在室温保存2小时内检测中性粒细胞比率(neutrophil granulocyte,NEU%)。

1.5.3 酶联免疫吸附法检测血清TNF-α、IL-1β含量 于造模后3小时(即推拿后2小时)耳缘静脉采血1 mL，置于红色真空采血管中，室内保存20分钟内进行离心，4℃ 3000 rpm离心20分钟，取上清置于EP管保存，按试剂盒方法测定血清中TNF-α、IL-1β含量。

1.5.4 蛋白免疫印迹法检测肝、肺组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达 于造模后3小时腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100g)，抽取腹主动脉血，取出适量大小肝脏、肺脏组织100 mg，将组织放于组织裂解液中研磨，每10分钟震荡1次，共震荡4次，混合液4℃、12000 rpm 离心20分钟，吸取上清。BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量，加5×蛋白上样缓冲液混匀，95℃变性5分钟。配置8%分离胶和5%浓缩胶，上样后稳定电泳浓缩胶60 V、分离胶80 V，冰上电转100 V 70分钟，10%脱脂奶粉封闭2小时，依据Maker裁膜，一抗(TLR4 1∶1000，NF-κB p65 1∶2000，GAPDH 1∶1000)室温摇床孵育1小时后4℃冰箱过夜。洗膜3次，孵育二抗(羊抗兔IgG 1∶10000，羊抗小鼠 IgG 1∶10000)，显影液均匀滴在膜上，成像仪显影，Image Lab图像分析软件分析目的条带，定量分析各蛋白条带灰度值。

1.6 统计学分析

注：A:开天门；B：推坎宫；C：揉太阳；D：揉耳后高骨；E：推脊；F：清天河水

2 结果

2.1 各组幼兔肛温变化比较

基础肛温：正常组基础肛温与模型组、推拿组相比，无显著性差异(P>0.05)；造模后1小时(推拿前)：推拿组与模型组无显著性差异(P>0.05)，推拿组和模型组肛温显著高于正常组(P<0.05)；造模后2小时、3小时、4小时(即推拿后1小时、2小时、3小时)：推拿组肛温显著低于模型组(P<0.05)；造模后5小时、6小时(即推拿后4小时、5小时)：推拿组肛温与模型组无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

表1 退热六法对各组幼兔肛温的影响

图2 退热六法对各组幼兔肛温的影响

造模后3小时、4小时、5小时、6小时，推拿组体反应指数明显低于模型组(P<0.05)。见表2。

表2 退热六法对各组幼兔体反应指数的影响

2.2 各组幼兔中性粒细胞比率变化比较

造模后3小时，推拿组NEU%显著低于模型组(P<0.05)；组内比较，模型组造模后1小时、3小时的 NEU%高于造模前(P<0.05)，推拿组只有造模后1小时的 NEU%高于造模前(P<0.05)；推拿组造模3小时 NEU%与造模前无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 退热六法对各组幼兔外周血中性粒细胞比率表达的影响

2.3 退热六法对发热幼兔血清炎症因子的影响

造模后3小时，模型组血清中TNF-α含量明显高于正常组(P<0.05)，推拿组血清中TNF-α含量明显低于模型组(P<0.05)；模型组血清中IL-1β含量高于正常组(P<0.05)，推拿组血清中IL-1β含量低于模型组(P<0.05)。见表 4。

表4 退热六法对各组幼兔血清炎症因子表达的影响

2.4 退热六法对发热幼兔肝、肺组织TLR4/NF-κB p65的影响

造模后3小时，推拿组和模型组肝、肺组织中TLR4、NF-κB p65表达高于正常组(P<0.05)；推拿组肝、肺组织中TLR4表达低于模型组(P<0.05)，推拿组和模型组NF-κB p65表达无明显差异(P>0.05)。见图5、6，表3、4。

表5 退热六法对各组幼兔肝组织TLR4及NF-κB p65蛋白表达的影响

表6 退热六法对各组幼兔肺组织TLR4及NF-κB p65蛋白表达的影响

图3 退热六法对各组幼兔肝组织TLR4/NF-κB p65表达的影响

图4 退热六法对各组幼兔肺组织TLR4/NF-κB p65表达的影响

3 讨论

小儿推拿手法治疗发热有着独特的优势，较口服及静脉给药更能获得家长的认可[12]，其疗效及机制问题，是推拿学科关注的热点之一，临床上小儿推拿退热的手法不统一，治疗范畴及机制不明确，以致疗效和安全性被质疑。魏理珍等[13]研究发现清天河水可能通过抑制下丘脑正调节介质前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量而降温。临床上推拿退热效果显著，推拿能下调发热患儿外周血清TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子水平[14]。因此，本研究探讨了推拿对炎症性发热的影响，结果提示推拿能明显抑制发热，抑制炎症反应，下调中性粒细胞比率，可能是通过TLR4信号通路实现。

根据研究发现，耳缘静脉注射0.5 μg/kg的LPS，造模成功率达83%，造模后1小时肛温明显升高，造模后3小时肛温达最高峰，与基础肛温相比，约上升1.6℃，随后肛温逐渐下降，持续约6小时，与研究相符[8]。选取退热六法作为干预方式，其中头面四大手法属于“和法”，可调节阴阳，天人相应，天河水倍受历代医者的推崇，均认为清天河水是“清法”的重要代表，在各种热证下均可施用，脊椎占督脉近三分之二的循行部位，推脊对督脉气机有调节作用。推拿后即刻便会出现降温现象，降温幅度最高达1℃。

发热是体温调节系统紊乱的表现，是反应炎症性疾病的重要标志，众所周知，TLR4介导的信号转导参与了慢性和急性炎症反应[15]，其中TLR4/NF-κB是炎症调节的经典信号通路，参与了炎症性发热的体液机制。炎性细胞因子能影响免疫反应，并对各种组织或器官造成损伤[16]。TNF-α、IL-1β参与调节早期免疫反应[17]，是发热的关键介质，其中肺脏、肝脏是失调炎症反应的潜在目标。基因敲除TNF-α后注射LPS，发现小鼠体温明显升高，说明TNF-α参与了负反馈机制，限制了发热的程度[18]，有研究表明注射TNF-α血清抗体能影响发热的早期阶段[19]，这与推拿后能即刻降低体温相似。IL-1β通过血液、体液途径直接作用于中枢引起发热[20]，中性粒细胞首先募集到发生感染的部位[21]，分泌IL-1β[22]，引起炎症反应，中性粒细胞具有两重作用，一则产生抑菌作用，二则存在细胞毒性，所以当其适当发挥效应后应抑制其活化和浸润，防止对机体产生伤害[23]，研究结果显示，退热六法作用于LPS模型兔后能抑制外周中性粒细胞增多，保护机体免受伤害。脂多糖是一种典型内毒素，作为配体可以激活细胞膜上的TLR4，启动下游炎症反应，上调促炎细胞因子。肝脏在调节各种新陈代谢、体内平衡、宿主防御活动中起着关键作用，能清除细菌和内毒素，发挥代谢、免疫等功能[24]，TLR4介导LPS诱导的肝组织损伤，使用TLR4抑制剂可以改善肝脏损伤和全身炎症[25]，LPS诱导大量促炎性介质将中性粒细胞募集到肺组织中，造成肺部的炎性损伤[26]，TLR4作为潜在的治疗标记，可用于抑制肺部的炎症反应，根据研究结果显示，退热六法干预能抑制肝脏和肺脏组织中TLR4的表达量。

综上，本研究揭示了退热六法对LPS引起的炎症性发热具有退热作用，研究表明，退热六法能抑制外周炎症反应，下调中性粒细胞比率，影响TLR4信号通路，下游通路不涉及NF-κB p65，这些结果为推拿治疗小儿发热提供了科学依据，回答了临床上推拿退热的部分理论机制。