临床常用中药制剂对OVCAR3细胞的药效学比较

隗雅姿， 袁庆东， 肖向茜*， 杨怡姝， 李劲涛， 盛 望

(1.北京工业大学，北京 100124；2.北京市羊坊店医院，北京 100038)

卵巢癌是常见的女性生殖器官肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌和宫颈癌，由于肿瘤位于盆腔深部，早期症状不典型，因此早期诊断困难，70%患者初诊即为中晚期。根据《2019 NCCN卵巢癌包括输卵管癌及原发性腹膜癌临床实践指南》[1]，目前除手术治疗之外，还是采用以铂为基础的联合化疗方案，常用药物为顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、多柔比星、贝伐珠单抗等[2-5]。由于上述化疗药物有较强的毒副作用[6]，有时候患者难以耐受，临床常常应用中药以减轻化疗药物的毒副作用，增强化疗药物的抗肿瘤活性。但是，某些临床常用中药单独应用在卵巢癌中的效果没有报道，并且这些中药在卵巢癌中的抗肿瘤活性强弱的比较也没有报道。因此，本研究选择几种临床常常用于肿瘤辅助治疗且文献报道在体内外单独应用时具有直接抗肿瘤活性的中药制剂，包括参芪扶正注射液[7]、消癌平注射液[8]、复方苦参注射液[9]、艾迪注射液[10]、康艾注射液[11]、康莱特注射液[12]等，或者中药来源的单体化合物(榄香烯注射液[13])，以顺铂[14]、紫杉醇[15-16]为对照药物，比较它们对OVCAR3细胞的抗肿瘤作用。

实时无标记细胞分析(RTCA)技术是基于微电子阻抗技术的细胞检测方法。细胞检测板的每个细胞生长孔底部铺有微电子细胞传感器芯片，可用于检测细胞贴附与生长，从而方便构建实时、动态、定量跟踪细胞增殖分化的细胞阻抗检测传感系统。当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时，这种改变与细胞的实时功能状态改变成相关性，通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物信息即细胞指数(cell index, CI)，包括细胞生长、伸展、形态变化、浸润及迁移、死亡和贴壁等。由于待测药物康莱特注射液是乳浊液，影响CCK8实验中对底物颜色的检测，因此，本研究主要采用RTCA法对细胞进行增殖、迁移和侵袭的研究。

1 材料

1.1 细胞 卵巢癌OVCAR3细胞系(上海泽叶生物科技有限公司)；人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞系(国家实验细胞资源共享平台)。

1.2 试剂与仪器 胎牛血清(FBS)、RPMI1640细胞培养液、MEM eagle’s细胞培养液、青链霉素、非必需氨基酸(NEAA)、PBS缓冲液(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Matrigel®Marix(美国Corning公司)；CCK8试剂盒[东仁化学科技(上海)有限公司]。RTCA活细胞检测仪、E-Plate 16、CIM-Plate[艾森生物(杭州)有限公司]；高内涵成像分析系统、多功能读板机(美国PerkinElmer公司)。

1.3 药物 参芪扶正注射液(国药准字Z1990065，广东丽珠集团利民制药厂，批号170833)；康莱特注射液(国药准字Z10970091，浙江康莱特药业有限公司，批号1709297-1)；复方苦参注射液(国药准字Z14021231，山西振东制药股份有限公司，批号20170312)；康艾注射液(国药准字Z20026868，长白山制药股份有限公司，批号03181003)；榄香烯注射液(H20110114，石家庄制药集团有限公司，批号18040602)；艾迪注射液(国药准字Z52020236，贵州益佰制药股份有限公司，批号20170844)；通关藤注射液(消癌平注射液)(国药准字Z20025868，南京圣和药业股份有限公司，批号201812071)；紫杉醇注射液(国药准字H20084439，华北制药股份有限公司，批号FPW1710001)；注射用顺铂(冻干型)(国药准字H20023461，齐鲁制药有限公司，批号FA4A7008A)。

2 方法

2.1 中药制剂对OVCAR3细胞增殖的影响 取E-Plate 16孔板，每孔内加入50 μL含10%FBS的RPMI1640培养液，放入RTCA实时细胞检测仪检测基线。将对数生长期的OVCAR3细胞消化并吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为5×104/mL，加入E-Plate 16孔板中，每孔100 μL，室温静置30 min使细胞沉降，放入实时细胞检测仪过夜贴壁。将药物进行连续稀释，每种制备5个剂量，每个剂量3个复孔，每孔50 μL，分别为榄香烯注射液10、20、40、60、80 μg/mL，参芪扶正注射液5、10、20、30、40 mg/mL，复消癌平注射液50、100、200、300、400 mg/mL，复方苦参注射液50、100、200、300、400 mg/mL，艾迪注射液15、30、45、60、75 mg/mL，康艾注射液20、40、60、80、100 mg/mL，康莱特注射液5、10、15、20、25 mg/mL，注射用顺铂(冻干型)5、10、20、40、80 μmol/L，紫杉醇注射液0.39、1.56、6.25、25、100 nmol/L，对照组加入等体积细胞培养液。加药后，立刻将E-Plate板放回检测仪中，检测72 h内细胞增殖曲线。上述实验重复2次。

2.2 中药制剂对OVCAR3细胞迁移的影响 在CIM Plate-16下室加入含10% FBS的RPMI1640培养液165 μL，作为实验组和阳性对照组；加入等体积不含FBS的RPMI1640培养液，作为空白对照组。安装上室并加入30 μL无血清培养液，将CIM Plate-16置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中平衡1 h，放入仪器检测基线。

取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，根据预实验结果，以无血清培养基调整细胞密度为4×105/mL。从RTCA仪器上取下CIM-Plate16孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，实验组每孔加入以无血清细胞培养液配制不同的药物，每种药物3个剂量，每个剂量3个复孔，每孔50 μL，分别为榄香烯注射液20、40、80 μg/mL，参芪扶正注射液10、20、40 mg/mL，消癌平注射液100、200、400 mg/mL，复方苦参注射液100、200、400 mg/mL，艾迪注射液30、45、60 mg/mL，康艾注射液60、80、100 mg/mL，康莱特注射液15、20、25 mg/mL，注射用顺铂(冻干型)5、10、20 μmol/L，紫杉醇注射液1.56、3.125、6.25 nmol/L，阳性对照组、空白对照组加入等体积无血清细胞培养液，将CIM Plate-16孔板放入RTCA仪器，检测24 h内细胞迁移情况。上述实验重复2次。

2.3 中药制剂对OVCAR3细胞侵袭的影响 根据预实验结果，用预冷的无血清RPMI1640培养液按照1∶40比例稀释Matrigel，最终使加入CIM-Plate 16孔板上室的体积为20 μL/孔，将包被Matrigel的上室放入37 ℃细胞培养箱中4 h，使胶凝固。上室中加入细胞悬液至密度为6×105/mL，仪器工作程序、药物浓度均与“2.2”项下相同，检测24 h内细胞侵袭情况。上述实验重复2次。

2.4 中药制剂对MRC-5细胞的增殖活性的影响 将MRC-5细胞制成密度为8×104/mL的单细胞悬液，在96孔板中每孔加入100 μL，过夜贴壁。将药物加入96孔板中(终剂量同“2.1”项)，每个剂量4个复孔，对照组加入细胞培养基，放置于细胞培养箱孵育72 h后加入CCK8试剂，并于细胞培养箱中孵育40 min，放入多功能读板机中测定450 nm处吸光度。上述实验重复3次。为了比较药物对肿瘤细胞和正常细胞的作用，同时对OVCAR3细胞也进行了72 h CCK8检测。

2.5 中药制剂对OVCAR3细胞凋亡的影响 根据细胞增殖实验结果，将各药物的稳定IC50近似浓度作为凋亡实验检测浓度，但有些药物未能计算出IC50(参芪扶正注射液、康艾注射液、康莱特注射液)，故再将原始药物稀释4倍，检测细胞线粒体膜电位变化。将4×104/mL OVCAR3细胞悬液加到96孔板中，每孔100 μL，过夜贴壁，加入药物，每种药物3个复孔，每孔100 μL，对照组加入等量细胞培养液，分别为榄香烯注射液50 μg/mL，艾迪注射液50 mg/mL，复方苦参注射液150 mg/mL，参芪扶正注射液35 mg/mL，消癌平注射液250 mg/mL，康艾注射液100 mg/mL，注射用顺铂(冻干型)10 μmol/L，紫杉醇注射液5 nmol/L。处理24 h后，吸出上清，每孔加入50 μL 1 μmol/L JC-1工作液，置于细胞培养箱中孵育1 h，PBS洗涤2次，加入50 μL 4 ℃预冷的成像缓冲溶液，在高内涵成像分析系统中拍照，检测荧光强度，计算红/绿荧光的比值(R/G)。另外，康莱特注射液为乳浊液，不易经洗涤去除，会影响在荧光显微镜下的观察相关，故不用于凋亡检测。上述实验重复3次。

3 结果

3.1 中药制剂对OVCAR3细胞增殖活性的影响 药物对OVCAR3细胞的作用曲线见图1。

注：参芪扶正注射液、康艾注射液、康莱特注射液在各剂量下均无明显抑制作用，无法计算IC50，故未绘制曲线。图1 中药制剂对OVCAR3细胞增殖的影响(n=2)

本实验设定每隔15 min仪器扫描各孔细胞状态1次，IC50随时间变化的曲线见图2。由此可知，榄香烯注射液、消癌平注射液、复方苦参注射液、艾迪注射液在与OVCAR3细胞作用36 h后IC50值基本稳定，且一直持续到72 h，提示今后可缩短上述药物观察时间。另外，取36～72 h内所有时间点(共144个)的IC50，计算平均值，较单点实验能更客观代表药物的抗肿瘤作用。

图2 IC50随时间变化的曲线(n=2)

3.2 中药制剂对OVCAR3细胞迁移的影响 RTCA实时细胞检测仪前2 h每隔2 min扫描OVCAR3细胞迁移状态1次，之后每15 min扫描1次，得到细胞指数。本实验检测榄香烯注射液、注射用顺铂(冻干型)处理OVCAR3细胞24 h内实时细胞迁移曲线和STD值，共计150个时间点，见图3。由此可知，在不同剂量下2种药物对OVCAR3细胞迁移均有抑制作用。

注：细胞迁移检测时间一般不超过24 h，以减少细胞增殖对检测结果的干扰。与阳性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 中药制剂对OVCAR3迁移的影响(n=2)

3.3 中药制剂对OVCAR3细胞侵袭的影响 药物处理OVCAR3细胞10～24 h内的实时细胞侵袭曲线和STD值见图4。由此可知，除了康莱特注射液、注射用顺铂(冻干型)、紫杉醇注射液外，其他药物至少在1个剂量下可抑制OVCAR3细胞侵袭。

3.4 中药制剂对MRC-5、OVCAR3细胞的毒性 表1显示，紫杉醇注射液IC50(MRC-5)/IC50(OVCAR3)大于5，即对MRC-5细胞的毒性远低于对OVCAR3细胞的毒性；榄香烯注射液、艾迪注射液、注射用顺铂(冻干型)IC50(MRC-5)/IC50(OVCAR3)约等于1，即对2种细胞的毒性相近；复方苦参注射液、参芪扶正注射液、消癌平注射液IC50(MRC-5)/IC50(OVCAR3)小于1，即对MRC-5细胞的毒性更高。

表1 中药制剂对MRC-5、OVCAR3细胞的毒性(n=3)

图5 中药制剂作用24 h后OVCAR3线粒体膜电位(×20)

3.5 中药制剂对OVCAR3细胞凋亡的影响 图5、表2显示，紫杉醇注射液、注射用顺铂(冻干型)、消癌平注射液、榄香烯注射液可引起线粒体膜电位改变(早期凋亡信号)，出现时间一般在药物作用10 h后，而其他药物在24 h内未观察到上述现象，其原因可能为剂量设定较低，导致需要更长时间才能发挥作用，也可能是通过其他途径来促进肿瘤细胞凋亡。

表2 中药制剂作用24 h后OVCAR3线粒体膜电位

4 讨论

中药用于肿瘤治疗已有多年，临床大多作为化疗药物的辅助治疗，本研究检测的多种中药以及来源于中药的单体化合物β-榄香烯在卵巢癌的临床应用也有较多报道。但是，相比之下哪种药物对卵巢癌具有直接的抑制作用且效果更好呢？目前尚无相关研究报道。本研究选择了几种临床常用，且文献有报道用于卵巢癌的中药以及中药温郁金提取物β-榄香烯作为待测药物，中药制剂均为市售静脉输液剂型。采用实时细胞检测技术，对给药后细胞增殖曲线进行检测，发现对于卵巢癌来说，榄香烯注射液、消癌平注射液、复方苦参注射液和艾迪注射液均有一定疗效。而参芪扶正注射液、康艾注射液和康莱特注射液在较高浓度下有一定作用，但是抑制作用较弱，不能计算出半数抑制浓度，但是本实验中也不宜提高药物浓度，因为市售注射液剂型为灭菌水或生理盐水配制，在细胞实验时至少稀释4倍方可忽略细胞培养液成分差异造成的影响。

在迁移实验中，设定高、中、低3个浓度，其中中浓度与IC50接近。未测得IC50值的药物则采用增殖抑制实验中较高的3个浓度。结果显示，除了注射用顺铂(冻干型)在IC50附近有抑制迁移的作用之外，只有榄香烯注射液在高浓度时可以抑制迁移，其他药物在实验浓度下抑制肿瘤细胞迁移的作用不明显，甚至康莱特注射液和康艾注射液两个药物在本实验中显示出肿瘤细胞迁移数量超过对照组。

在侵袭实验中，榄香烯和大多数中药都显示出了一定的抑制作用，包括在增殖抑制实验和迁移实验中效果不佳的康艾注射液，高浓度时也显示出了抑制侵袭的作用。不过康莱特注射液和紫杉醇注射液的效果不佳。

本实验显示紫杉醇注射液抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的作用弱。Chang等[17]在2017年发现紫杉醇促进小鼠乳腺癌肺转移的分子机制，紫杉醇通过Atf3基因使肿瘤周围的血管密度增加，促进乳腺癌细胞进入血液循环，同时促进肺组织中的穿孔素(存在于细胞毒性T细胞和NK细胞)表达下调，炎性单核细胞数量上调，趋化因子配体2表达上调，从而改变了肺组织的微环境，使肿瘤细胞更利于在肺组织定植。

抗肿瘤化疗药物往往对正常组织细胞也有一定的毒性作用，部分患者因不能耐受药物的副作用而停止化疗。中药达到抑制肿瘤细胞增殖效果时，其对正常组织细胞的作用鲜见报道。中药制剂的毒副作用发生的靶组织和靶细胞不尽相同，本研究只选取了一种人胚肺成纤维细胞系MRC-5代表正常细胞进行实验，如果需要了解中药制剂对正常组织器官的毒理学作用，还需要更多的实验研究。在本实验中，紫杉醇注射液对MRC-5毒性最低，其次是榄香烯注射液、艾迪注射液和注射用顺铂(冻干型)，对成纤维细胞和卵巢癌细胞的毒性相近，而在增殖抑制实验中有一定效果的复方苦参注射液和消癌平注射液对成纤维细胞的毒性甚至大于对OVCAR3细胞的毒性。

为了便于比较，肿瘤细胞线粒体膜电位的检测采用中药制剂的IC50附近浓度。经过连续观察，发现24 h内出现明显细胞凋亡的药物有注射用顺铂(冻干型)、紫杉醇注射液、榄香烯注射液和消癌平注射液。

综上所述，在临床常用的化疗辅助药物中，榄香烯注射液无论在对OVCAR3细胞的增殖抑制、迁移抑制、侵袭抑制、促进凋亡等方面，还是对正常细胞系MRC-5的毒性方面，都是效果最好的。艾迪注射液虽然对OVCAR3细胞迁移抑制作用不明显且未检测到24 h内的线粒体细胞膜电位改变，但是对肿瘤细胞有增殖抑制作用且对成纤维细胞的毒性较小，是仅次于榄香烯注射液的化疗辅助药物。复方苦参注射液和消癌平注射液表现出对成纤维细胞毒性作用强于卵巢癌细胞，提示应用于对化疗药物敏感的患者时需要更加注意来自于中药制剂的毒副作用。