基于UPLC-Q-TOF-MS/MS法的耳聋胶囊化学成分辨识及归属

李 偲， 张东旭， 刘羽康， 张爱杰， 刘兴超， 樊慧蓉*

(1.天津中医药大学，天津 301617；2.中国医学科学院放射医学研究所，天津 300192；3.河北中医学院，河北 石家庄 050200；4.河北省高校中药组方制剂应用技术研发中心，河北 石家庄 050200)

耳聋丸收载于2020年版《中国药典》一部，由龙胆、黄芩、栀子、地黄、木通、当归、泽泻、九节菖蒲、羚羊角、甘草组成，具有清肝泻火、利湿通窍之功效，临床上常用于肝胆湿热所致的头晕头痛、耳聋耳鸣和耳内流脓等病症。耳聋胶囊由耳聋丸组方药材经现代制药工艺加工而成，具有生物利用度高、服用方便等优点，疗效显著[1-3]。

目前，关于耳聋胶囊化学成分尚缺乏系统研究，仅有少数报道针对黄芩苷[4-5]和栀子苷[5]进行含量测定，无法全面反映该制剂活性物质。本实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法，结合对照品、HR-MS/MS Spectral Library1.1质谱数据库及文献报道对耳聋胶囊化学成分进行鉴定，并明确其药材归属，完善其化学成分谱，以期为其后续药效物质基础和质量控制研究奠定基础。

1 材料

Nexera UPLC LC-30A色谱仪(日本岛津公司)；Triple TOF 4600高分辨质谱仪、Analyst 1.7.1 色谱工作站、PeakView 2.2 数据处理系统(美国AB Sciex公司)；色谱柱(上海沃特世科技有限公司)。

耳聋胶囊(唐山景忠山国药有限公司，批号190802)。对照品甘草素(批号ZZS-20-076-A4)、绿原酸(批号ZZS-20-114-A8)、龙胆苦苷(批号ZZS-20-193-D6)、黄芩苷(批号ZZS-20-103-A1)、黄芩素(批号ZZS-19-017-A6)、汉黄芩素(批号ZZS-20-193-N5)、23-乙酰泽泻醇B(批号ZZS-20-193-K2)、木通苯乙醇苷B(批号ZZS-20-193-P7)、阿魏酸(批号ZZS-20-087-B5)、藁本内酯(批号ZZS-20-196-A2)、甘草酸(批号ZZS-20-193-O6)、甘草次酸(批号ZZS-20-196-A7)、京尼平(批号ZZS-20-196-J9)、京尼平苷酸(批号ZZS-20-193-M9)、原儿茶酸(批号ZZS-20-104-A2)均购自甄准生物科技有限公司；栀子苷(批号110749-201718)、甘草苷(批号111610-201607)、山柰酚(批号D3ON-QH1T)、槲皮素(批号110759-201105)、熊果酸(批号110742-201622)均购自中国食品药品鉴定研究院；7-羟基香豆素(批号50112)购自Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；毛蕊花糖苷(批号wkq16062004)、梓醇(批号wkq17030904)、甘草酸铵(批号wkq16082203)均购自四川省维克奇生物科技有限公司；5-羟甲基糠醛(批号G1040044)购自DRC公司；丁香酚(批号D-064-161216)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。甲醇(美国Fisher Scientific公司)、甲酸(天津大茂化学试剂有限公司)均为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件 Waters Atlantis T3色谱柱(4.6 mm×100 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～2 min，96% B；2～6 min，96%～35% B；6～41 min，35%～0% B；41～48 min，0% B；48～48.5 min，0%～96% B；48.5～56 min，96% B)；体积流量0.6 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。

2.1.2 质谱条件 电喷雾正、负离子模式，MS扫描范围m/z50～1 000，MS2扫描范围m/z50～1 000；离子源温度500 ℃；离子喷雾电压5 500 V/-4 500 V；离子源气体1、2均为60 psi(1 psi=6.895 kPa)；气帘气压力35 psi；去簇电压±40 V；MS碰撞能±10 eV，MS2碰撞能±35 eV。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各固体对照品适量，加甲醇溶解制成含各成分1 mg/mL的溶液，各取100 μL混合，甲醇稀释至20 μg/mL，即得，过0.22 μm微孔滤膜后进样分析。

2.2.2 供试品溶液 精密称取胶囊内容物1 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，加入65%甲醇20 mL，超声(250 W、40 kHz)处理50 min，放冷，65%甲醇补足减失质量，12 000 r/min离心5 min后取上清液过0.22 μm微孔滤膜，续滤液稀释10倍，即得。

2.2.3 数据处理与分析 对于有对照品的成分，通过比对对照品及其保留时间和质谱碎片特征进行鉴定；对于没有对照品的成分，一是应用Analyst IF1.7.1、Peakview2.2软件结合HR-MS/MS Spectral Library 1.1数据库在规定的质量数偏差5×10-6内对供试品溶液化学成分的保留时间和质谱信息进行比对分析；二是通过查阅中英文相关文献，收集已报道的组方药材中化学成分信息，包括名称、分子式、CAS号、化学结构及质谱碎片离子信息等，建立耳聋胶囊的初步化学成分数据库。最终，采用“对照品-数据库-文献报道”综合分析策略对耳聋胶囊所含化学成分进行鉴定和辨识。

3 结果

基峰色谱图见图1，共鉴定出130种成分，包括46种黄酮及其苷类、30种萜类、10种苯酞类、4种香豆素类、6种苯乙醇苷类、12种有机酸类、13种含氮类、9种其他类，其中9种来源于君药龙胆，21种来源于臣药黄芩，36种来源于臣药栀子，16种来源于地黄，3种来源于木通，11种来源于泽泻，19种来源于当归，4种来源于九节菖蒲，9种来源于羚羊角，23种来源于甘草，山柰酚为龙胆和栀子的共有成分，绿原酸及亚油酸为栀子和当归的共有成分，蔗糖和棕榈酸归属于全部药味。各成分鉴定结果和药材归属结果见表1(化合物1～66为正离子模式下检测得到，化合物67～130为负离子模式下检测得到)。

3.1 黄酮类 该类化合物裂解方式主要有糖苷键断裂、RDA裂解重排、脱去中性碎片、丢失羰基、糖环裂解和交叉环切除等。典型化合物104在保留时间9.69 min时检测到准分子离子峰m/z285.040 6[M-H]-，经质谱软件和元素组成预测分子式C15H10O6，碎片离子有m/z257.047 3[M-H-CO]-、 239.032 4[M-H-CO-H2O]-、 211.041 0[M-H-2CO-H2O]-，同时母离子发生RDA裂解脱去C4H4O3和C8H6O2分子，得到碎片离子m/z185.057 7和151.034 2，与对照品和文献[16]比对后推测为山柰酚，为君药龙胆和臣药栀子的共有成分，其质谱裂解途径见图2。

图1 耳聋胶囊基峰色谱图Fig.1 BPC chromatograms of Erlong Capsules

图2 山柰酚质谱裂解途径Fig.2 Fragmentation pathway of kaempferol

3.2 萜类

3.2.1 环烯醚萜及其苷类 该类化合物裂解途径主要为糖苷键断裂及丢失CO2、H2O、CH3OH、CH3COOH等中性分子或母核上的一些取代基。典型化合物86在正离子模式下准分子离子峰为m/z357.117 6，推测其分子式C16H20O9，二级质谱可见碎片离子m/z195.064 9[M+H-Glu]+、177.054 0[M+H-Glu-H2O]+、149.059 4[M+H-Glu-H2O-CO]+，结合对照品、数据库匹配和文献[12]推测为龙胆苦苷，为君药龙胆的《中国药典》含量测定指标性成分，其质谱裂解途径见图3，保留时间7.94 min，准分子离子峰为m/z411.126 3[M+Na]+，推断分子式C17H24O10，其质谱裂解途径见图4，结合对照品信息、文献[13]和数据库匹配推测为栀子苷，为臣药栀子的《中国药典》含量测定指标性成分。

表1 耳聋胶囊化学成分鉴定和药材归属结果

续表1

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图3 龙胆苦苷质谱裂解途径Fig.3 Fragmentation pathway of gentiopicroside

图4 栀子苷质谱裂解途径Fig.4 Fragmentation pathway of geniposide

3.2.2 三萜及其苷类 该类化合物常丢失一分子或多分子糖基形成苷元离子，苷元离子则易失去一分子水，准分子离子可通过C-23和C-24之间重排得到碎片离子。典型化合物61准分子离子峰m/z515.372 6[M+H]+，保留时间为28.12 min，预测可能分子式C32H50O5，二级质谱中可见m/z497.363 5[M+H-H2O]+、 437.340 5[M+H-H2O-CH3COOH]+、383.292 1[M+H-H2O-C6H10O2]+、365.284 4[M+H-2H2O-C6H10O2]+，通过对照品比对、文献[24-25]和数据库匹配可以确定为23-乙酰泽泻醇B，为组方药材泽泻的《中国药典》含量测定指标性成分，其质谱裂解途径见图5。

图5 23-乙酰泽泻醇B质谱裂解途径Fig.5 Fragmentation pathway of Alisol-B 23-acetate

3.3 苯酞类 该类化合物裂解特征主要分为2类，一是侧链断裂脱烯，产生[M+H-CnH2n]+等碎片离子；另一类则表现为开环连续丢失H2O和CO分子。典型化合物38保留时间为15.35 min，准分子离子峰m/z191.106 9，推测分子式C12H14O2，二级裂解碎片可见m/z173.096 0[M+H-H2O]+、163.111 1[M+H-C2H4]+、149.059 5[M+H-C3H6]+、145.100 9[M+H-HCOOH]+、117.069 5[M+H-HCOOH-C2H4]+和105.070 1[M+H-HCOOH-C3H4]+，结合对照品信息、文献报道[22]及数据库匹配结果推测为Z-藁本内酯，为组方药材当归的主要活性成分之一，其质谱裂解途径见图6。

图6 Z-藁本内酯质谱裂解途径Fig.6 Fragmentation pathway of Z-Ligustilide

3.4 香豆素类 该类化合物二级裂解特征主要为母离子丢失中性分子。典型化合物15保留时间为8.02 min，准分子离子峰m/z193.049 7[M+H]+，推测分子式C10H8O4，二级裂解可见碎片离子m/z165.055 4[M+H-CO]+、147.055 1[M+H-CO-H2O]+、137.059 0[M+H-2CO]+和119.049 0[M+H-2CO-H2O]+，结合文献[9，15]和数据库匹配结果推测为东莨菪内酯，为组方臣药栀子的主要活性成分之一，其质谱裂解途径见图7。

图7 东莨菪内酯质谱裂解途径Fig.7 Fragmentation pathway of Scopoletin

4 讨论

中医认为，中耳炎等耳部疾病与肝火上扰证密切相关；西医认为，其发病机制主要为氧化损伤、炎性因子、微循环障碍、细胞凋亡、神经损伤和免疫反应等[37-39]。本研究较为全面地阐明了耳聋胶囊的化学成分，基本涵盖了10味组方药材，其中多数成分与耳部疾病发病机制有关。例如，在氧化损伤、抗炎和微循环调节方面，君药龙胆中龙胆苦苷可降低肿瘤坏死因子-α、白介素-6、一氧化氮和丙二醛含量[40]；臣药黄芩中黄芩苷、黄芩素对羟基自由基、超氧自由基和过氧自由基都具有一定的清除能力[41]；臣药栀子中栀子苷和东莨菪内酯能够显著抑制体内外TNF-α、IL-6和白介素-1β的产生[42-43]；地黄中梓醇[44]和5-羟甲基糠醛[45]也具有一定的抗氧化损伤作用；泽泻中23-乙酰泽泻醇B具有抗炎[46]作用；当归中苯酞类如藁本内酯和黄酮类化合物具有较好的抗氧化和抗炎作用[47]；九节菖蒲中β-细辛醚可能通过抑制NF-κB转录与表达而起到抗炎作用[48]；甘草中甘草苷可以通过提高超氧化物歧化酶活性来减少自由基[49]，抗炎物质基础主要为甘草酸、甘草次酸和甘草总黄酮[50]。在细胞凋亡方面，山柰酚可以抑制常见耳毒性药物顺铂诱导的细胞凋亡[51]，地黄中梓醇可通过调节Bcl-2、Bax基因表达来抑制细胞凋亡[52]；在神经损伤方面，地黄中梓醇和毛蕊花糖苷被证实具有神经保护作用[53-55]；在免疫反应方面，地黄中(异)毛蕊花糖苷具有免疫调节的作用[56]。

综上所述，UPLC-Q-TOF-MS /MS法可对耳聋胶囊化学成分进行检测，而“对照品-数据库-文献报道”策略能有效提高鉴定准确性和可信度，为其后续药效物质基础、作用机制、质量控制研究提供参考。