基于UPLC-MS/MS的松龄血脉康胶囊血清药物化学研究△

郝晓锋，赵曼茜，肖云川，叶亮，柯潇

成都康弘制药有限公司，四川 成都 610036

松龄血脉康胶囊由葛根、鲜松叶、珍珠层粉组方而成，是一种用于平肝潜阳、镇心安神的中成药。目前，已从松龄血脉康胶囊各组分中系统地分离和鉴定了数百种化合物[1-4]，但其潜在药效物质基础尚不明确。本研究根据血清药物化学的相关理论基础结合超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS），初步研究松龄血脉康胶囊的血清药物化学，以探究其发挥药效的物质基础。

1 材料

1.1 实验动物

无特定病原体（SPF）级雄性SD 大鼠10只，体质量160～220 g，购于成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（川）2014-028，实验前动物适应性饲养5 d，禁食12 h，自由饮水。

1.2 试药与仪器

松龄血脉康胶囊（批号：140656，成都康弘制药有限公司）；鲜松叶、葛根药材（成都康弘药业集团股份有限公司，批号分别为20150501、1504001）由成都中医药大学严铸云教授分别鉴定为马尾松Pinus massonianaLamb.的松针和野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi 的干燥根；对照品葛根素（批号：110752-201313，纯度：98%）、大豆苷（批号：111738-201302，纯度：91.3%）和大豆苷元（批号：111502-200402）购于中国食品药品检定研究院；对照品芒柄花苷（批号：xFO65770，纯度＞98%，英国Biosynth Carbosynth 公司）；对照品马尾松苷B、马尾松苷D、(6S,7E,9R)-长寿花苷、异落叶松脂醇-9′-O-阿拉伯糖苷和儿茶素（纯度＞98%，实验室前期分离）；色谱纯乙腈和甲醇（韩国Honeywell Burdick&Jackson 公司）；AR 级甲酸（批号：2015030201，成都市科隆化学品有限公司）；其他试剂为分析级；1290 型UPLC 仪（美国安捷伦公司）；Quest LTQ 型质谱仪（美国Thermo 公司）；Milli-Q Biocel型超纯水仪（美国Millipore公司）。

2 方法

2.1 松龄血脉康胶囊样品的制备

松龄血脉康胶囊研磨成细粉，精确称量100 mg，加入蒸馏水10 mL，超声提取10 min（600 W，40 kHz），0.45 μm滤膜滤过，取滤液10 μL进行UPLC-MS/MS分析。

2.2 血浆样品的制备

松龄血脉康胶囊内容物用蒸馏水分散作为储备溶液（0.5 g·mL-1）。将上述储备液灌胃给予5 只大鼠（10 mL·kg-1），将等剂量的蒸馏水灌胃给予另外5 只大鼠作为对照。大鼠给药后60 min，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，从腹主动脉收集血液，4 ℃、1000 r·min-1离心10 min（离心半径为8.6 cm）分离上清液。取上清液0.5 mL 加入甲醇1.5 mL，涡旋60 s 混匀，10 000 r·min-1离心10 min（离心半径为8.6 cm），收集上清液，并在室温下用氮气吹干。将残留物重新溶解在甲醇200 μL中，10 000 r·min-1离心10 min（离心半径为8.6 cm），取上清液进行UPLC-MS/MS系统分析。

2.3 UPLC-MS/MS分析条件

2.3.1 色谱条件 Eclipse Plus C18RRHD 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温为30 ℃，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～3 min，5%B；3～15 min，5%～10%B；15～25 min，10%～20%B；25～40 min，20%～40%B；40～45 min，40%～100%B；45～50 min，100%B；50～51 min，100%～5%B；51～60 min，5%B），流速为0.20 mL·min-1，进样体积为5 μL。

2.3.2 质谱条件 正、负离子模式采集。正离子模式：喷雾电压为3.5 kV，鞘气压力为15 arb，辅助气压力为5 arb，吹扫气压力为0 arb，毛细管温度为275 ℃，毛细管电压为10 V，透镜电压为80 V；负离子模式：喷雾电压为5000 V，鞘气压力为15 arb，辅助气压力为5 arb，吹扫气压力为0 arb，毛细管温度为275 ℃，毛细管电压为-10 V，透镜电压为-100 V。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应度最高的3 个峰用于二级质谱分析，碰撞气体为氦气，碰撞能量为35 eV，全扫描范围为m/z200～800。

3 结果与讨论

采用UPLC-MS/MS 对松龄血脉康胶囊及灌胃松龄血脉康胶囊后大鼠血浆样品进行检测分析，松龄血脉康胶囊提取物、大鼠给药血浆样品及空白血浆样品正、负离子模式下的质谱图见图1～2。通过对比松龄血脉康胶囊提取物的质谱图和相关文献数据及数据库等信息，从松龄血脉康胶囊中初步鉴定出76 个化学成分，具体信息见表1；从给药松龄血脉康胶囊的大鼠血清中共鉴定了20 个移行成分，包括9个原型化合物和11个代谢产物，具体信息见表2。

表1 松龄血脉康胶囊成分的UPLC-MS/MS分析

续表1

续表1

表2 大鼠血中移行成分的UPLC-MS/MS分析

图1 松龄血脉康胶囊、给药组大鼠血浆和对照组大鼠血浆正离子模式下离子流图

3.1 松龄血脉康胶囊化学成分鉴定

3.1.1 通过对照品鉴定的成分 通过与对照品的保留时间和质谱数据进行比较，化合物9、20、23、32、33、42、66、67、71 分别鉴定为儿茶素、(6S,7E,9R)-长寿花苷、葛根素、大豆苷、马尾松苷B、异落叶松脂素-9′-O-阿拉伯糖苷、马尾松苷D、芒柄花苷和大豆苷。

图2 松龄血脉康胶囊、给药组大鼠血浆和对照组大鼠血浆负离子模式下离子流图

3.1.2 通过化合物的裂解规律并结合文献分析鉴定的成分 化合物4、7、10、18、25、27 在正离子模式下给出m/z417，399 碎片离子，在负离子模式下给出m/z415，295 碎片离子，表明这些化合物为葛根素（23）衍生物。化合物4、10、18 有相似的质谱图，鉴定为葛根素葡萄糖苷衍生物[5-7]。化合物25 和27 在m/z549[M+H]+有相同的分子离子峰，并且二级质谱给出m/z417，399，通过与文献对比，分别鉴定为葛根素木糖苷和葛根素芹糖苷[1]。化合物7 在m/z711[M+H]+和709[M-H]-处显示分子离子，并在正离子模式下给出m/z565，417，399 碎片离子，与文献数据对照，鉴定为4′-O-葡萄糖基-葛根素芹菜糖苷[8]。

化合物47、49、50 正离子模式下给出m/z431，413，311 碎片离子，负离子模式下给出m/z429，309 碎片离子，表明这些化合物为葛根素甲基化衍生物。化合物50 的分子离子m/z431 [M+H]+和429 [M-H]-，以及正离子模式下碎片离子m/z413[M+H-H2O]+，311[M+H-H2O-C4H6O3]+和负离子模式下碎片离子309 [M-H-C4H8O4]-，显示化合物50 为4′-甲氧基葛根素[9]。化合物47 和49 有相同的分子离子m/z563 [M+H]+，并且二级碎片给出特征离子m/z431，413，通过与文献对比，分别鉴定为4′-甲氧基-6″-O-木糖葛根素和4′-甲氧基-6″-O-芹糖葛根素[9]。

化合物3、11、13、14、16、17、24、36 正离子模式下给出m/z433，415 碎片离子，负离子模式下给出m/z431，311 碎片离子，表明这些化合物为葛根素羟基化衍生物。化合物11和24质谱特征为羟基葛根素[1,10]。化合物3 和13 质谱特征为羟基葛根素葡萄糖苷[11-12]。化合物14、17 和36 有相同的分子离子峰m/z565 [M+H]+，并且二级质谱给出特征离子m/z433，415，通过与文献对比，分别鉴定为染料木素-8-C-芹糖葡萄糖苷、3′-羟基-6″-O-木糖葛根素和3′-甲氧基-6″-O-芹糖葛根素[1,13]。化合物16 分子离子m/z727[M+H]+和725[M-H]-，并且正离子模式下给出m/z595[M+H-Api]+、565[M+H-Glu]+和433 [M+H-Api-Glu]+碎片离子。因此初步鉴定为3′-羟基-4′-O-葡萄糖基-6″-O-芹糖葛根素。

化合物5、26、29、31、65 正离子模式下给出m/z447，429碎片离子，负离子模式下给出m/z445，325 碎片离子，表明这些化合物为葛根素甲氧化衍生物。化合物26和31质谱特征为甲氧基葛根素[14-15]；化合物5 的分子离子m/z609[M+H]+和碎片离子m/z447，显示为甲氧基葛根素葡萄糖苷[16]；化合物29和65 有相同的分子离子m/z579[M+H]+和特征碎片离子m/z447，429，通过文献分别鉴定为3′-甲氧基-6″-O-木糖葛根素和4′,7-二羟基-3′-甲氧基异黄酮8-C-芹糖基-葡萄糖苷[16-17]。

化合物37 分子离子m/z463 [M+H]+和461 [MH]-，以及碎片离子m/z445 [M+H-H2O]+和341[M-H-C4H8O4]-，根据文献鉴定为圆锥黄檀亭[18]。

化合物8、30、32、38 产生碎片离子m/z255，表明这些化合物为大豆苷元（71）衍生物。化合物38在丢失葡萄糖基后显示与化合物32相同的离子碎片m/z255，鉴定为大豆苷元-4′-O-葡萄糖苷[19]。化合物8 和30 分别在m/z579 和549 处产生分子离子[M+H]+，二级质谱在m/z255产生碎片离子。通过文献分析，分别鉴定为大豆苷元-4′,7-二葡萄糖苷和(-)-葛扁豆异黄苷[1,20]。

化合物62、67、69、70 产生碎片离子m/z269，表明这些化合物应该是大豆苷元甲基化衍生物。化合物69与67相比有相同的分子离子和碎片离子，鉴定为异芒柄花苷[21]；化合物62 显示分子离子m/z563[M+H]+及特征碎片离子m/z431，269，通过文献查阅暂定为黄甘草苷[22]；化合物70 显示分子离子m/z461[M+H]+及特征碎片离子m/z299，通过文献对比鉴定为8-甲氧基芒柄花苷[23]。

化合物6、19、21、22、43、46 产生碎片离子m/z271，表明这些化合物为大豆苷元羟基化衍生物。化合物21和46有相同的质谱特征，被鉴定为羟基大豆苷元葡萄糖苷[1,24]；化合物6 和19 有相同的质谱特征，鉴定为羟基大豆苷元葡萄糖苷[25-26]；化合物43 显示分子离子565 [M+H]+，以及特征碎片离子m/z433，271，通过文献分析暂定为葛扁豆异黄苷素[27]；化合物22 显示分子离子m/z727 [M+H]+，产生碎片离子m/z595，565，433，271，因此初步鉴定为葛扁豆异黄苷素-4′-O-葡萄糖苷。

化合物12、34、72、74 产生碎片离子m/z285，表明这些化合物应该是大豆苷元甲氧基化衍生物。化合物34和74相比，失去葡萄糖基后有相同的离子特征，鉴定为甲基大豆苷元葡萄糖苷[28-29]；化合物12 鉴定为甲基大豆苷元双葡萄糖苷[6]；化合物72 显示分子离子m/z579[M+H]+、623[M+HCOOH-H]-和577 [M-H]-，并且正离子模式下产生碎片离子m/z447，285，负离子模式下产生碎片离子m/z283，通过文献分析暂定为4′,5,7-三羟基-异黄酮-6-甲基醚-7-O-木糖基-葡萄糖苷[30]。

化合物39、52、64、73、78 给出了相同的m/z248 的丢失，表明在这些化合物中应该存在6″-O-丙二酰葡萄糖基。化合物39、52、64、73、78 分别在m/z519，533，519，517，533处产生分子离子[M+H]+，二级质谱中失去6″-O-丙二酰葡萄糖基后，分别在m/z271，285，271，269，285 处产生碎片离子，通过查阅文献分别鉴定为染料木素-4′-(6″-O-丙二酰葡萄糖苷)、6″-O-丙二酰染料木苷、6″-O-丙二酰染料木素、6″-O-丙二酰芒柄花苷、6″-O-丙二酰鹰嘴豆芽素A[10,31-32]。

化合物60、61、77 给出了相同的m/z204 的丢失，表明在这些化合物结构中应该存在6″-O-乙酰葡萄糖基。化合物60、61、77 分别在m/z459，507，473处产生分子离子[M+H]+，二级质谱中失去6″-O-乙酰葡萄糖基后，分别在m/z259，303，269 处产生碎片离子，通过查阅文献分别鉴定为6″-O-乙酰大豆苷、6″-O-乙酰异槲皮苷和6″-O-乙酰芒柄花苷[6,23,33]。

化合物45 在m/z637 [M+H]+处显示分子离子，由于葡萄糖基的丢失，其在m/z475[M+H-Glu]+处产生碎片离子，并且在m/z313 处产生与化合物63相同的离子。通过查阅文献分别鉴定为葛根苷B 和葛根苷C[34]。

化 合 物15[35]、28[36]、35[3]、40[3]、44[37]、48[3]、51[38]、53[39]、54[40]、57[41]、58[42]、59[4]、68[43]、75[3]、76[3]和79[3]根据各自的分子离子和碎片离子特征鉴定结果见表1。

3.2 大鼠血浆中移行成分鉴定

3.2.1 大鼠血浆中原型成分的鉴定 通过比较给药组大鼠血浆与空白对照组大鼠血浆和松龄血脉康胶囊组的保留时间和质谱特征，9 个化合物被认为是松龄血脉康胶囊的原型成分，分别鉴定为葛根素（23）、染料木素-8-C-葡萄糖苷（24）、3′-甲氧基葛根素（26）、米里菲菌素（27）、β-谷甾醇（28）、大豆苷（32）、大豆苷元-4′-O-葡萄糖苷（38）、4′-甲氧基-6′-O-芹菜酰葛根素（49）和4′-甲氧基葛根素（50）。结果显示，在给予松龄血脉康胶囊提取物后，可从大鼠血浆中明确地检测到异黄酮类化合物原型。

3.2.2 大鼠血浆中代谢产物的鉴定 为了准确鉴定代谢物，首先对药物在体内的代谢规律进行分析。如上所述，异黄酮是松龄血脉康胶囊的主要成分，其主要的代谢途径是葡萄糖醛酸化、硫酸酯化和甲基化。在质谱特征中m/z176的丢失在结构上可归为葡糖醛酸基团，如M2～M6 和M8～M11，m/z80 的丢失可被认为是结构中的磺化基团，如M1 和M7。以上述鉴定的松龄血脉康胶囊成分为基础，大鼠血浆中代谢产物鉴定如下。

代谢物M2和M3在m/z431[M+H]+和429[M-H]-产生相同的分子离子。并且在正离子模式下都有m/z255的碎片离子，推测结构为大豆苷元的葡萄糖醛酸衍生物[44-45]。

代谢物M5 和M8 在m/z461 [M+H]+和459 [MH]-产生相同的分子离子。且在正离子模式下都有m/z285 的碎片离子，推测化学结构分别为黄豆黄素葡萄糖醛酸酯和甲氧基大豆苷元葡萄糖醛酸酯[46]。

同理M9～M11根据各自的分子离子和碎片离子特征鉴定结果见表2。

代谢物M6 的分子离子为m/z447 [M+H]+、445[M-H]-，并且在正离子模式下给出m/z271 的碎片离子，推测结构为染料木素葡萄糖醛酸酯[47]。代谢物M1 负离子模式下的分子离子m/z495[M-H]-和碎片离子m/z415，253 显示M1 为大豆苷硫酸酯[48]。代谢物M7负离子模式下的分子离子m/z333[M-H]-和碎片离子253[M-H-80]-，推测M7 为大豆黄素硫酸酯[49]。

4 结论

鲜松叶为松龄血脉康胶囊的君药，但在本研究中松龄血脉康胶囊含药血清中未能发现鲜松叶特征来源的化合物，可能是由于鲜松叶中存在较多挥发油成分和大极性成分，在UPLC-MS/MS 中不易表征。对于这些成分还需采用其他适合的方法来进行进一步分析和鉴定。本研究通过UPLC-MS/MS 快速分析鉴定了松龄血脉康胶囊的76 个化学成分和20 个入血移行成分，包括9 个原型成分和11 个代谢物。初步揭示了松龄血脉康胶囊潜在的药效物质基础，为松龄血脉康胶囊作用机制的研究提供了参考。