利用沉积物和水体的环境DNA检测鱼类物种多样性的差异

周春花，钟伟翔，陈金萍，欧阳珊,b，吴小平,b*

(南昌大学a.生命科学学院；b.鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室，江西 南昌 330031)

人为活动对于全球生物多样性具有广泛影响，并可能对生态系统服务和功能产生负面影响[1]。淡水生态系统中生物多样性丧失的速度越来越快，超过了陆地或海洋环境[2]。这使得人们迫切需要开发监测工具，以快速、准确地监测淡水生态系统中的生物群落组成。现有的生物多样性调查技术(网捕)因其方法上的局限性(例如，观察者偏见、对物种的二次伤害)而受到批评[3]。一种可能克服上述一些局限性的方法是使用在环境样本(例如水、土壤或沉积物)中发现的DNA来推断生态系统中的生物体是否存在[4]。这种被称为环境DNA(environmental DNA,eDNA)的遗传物质是组织、细胞、亚细胞碎片和在生物正常生活和死亡过程中丢失到环境中的胞外DNA的多聚分散混合物[5]。环境DNA调查已用于通过qPCR分析进行目标检测(即单一物种)，以及用于使用宏条形码技术的群落(即多物种)研究[6-7]。近年来，环境DNA宏条形码已被广泛运用于淡水生态系统的渔业管理与多样性监测中[8]。在美国上百个池塘、小溪、河流的生物多样性调查中发现多种两栖动物、鱼类、哺乳动物、昆虫和甲壳类动物[9]。通过使用多对鱼类宏条形码引物从水库中检测出了传统方法监测到的所有鱼类物种[10]。Zhang等对基于环境DNA技术系统研究了空间采样设计对3个不同大小的湖泊的鱼类群落结构的影响，结果支持岸边采样同样有效[11]。这些调查非常敏感，一旦方法得到优化，就可以实现自动化[12]。然而，其有效性和可复制性依赖于恰当的实验设计和对取样、测序文库制备和生物信息学分析过程中方法选择的影响的理解[13]。虽然一致认为环境DNA调查信息丰富，可以补充其他生物多样性监测方法[14]，但eDNA对不同环境样本类型如何影响物种可检测性的研究仍然很少[15]。

鄱阳湖为中国最大的淡水湖泊，是生物多样性的热点区[16]。近年来，围湖造田、湖沙挖掘、拦河筑坝、围堤养殖、过度捕捞等人类活动，严重影响鄱阳湖的生物多样性(特别是鱼类物种)。鄱阳湖生物多样性与生态平衡问题受到国家和政府的密切关注，制定了相关的禁渔措施[17]。鄱阳湖生物多样性保护与生态恢复迫切需要建立快速有效和环境友好的监测机制，为渔业管理以及生态保护政策的制定与实施提供科学依据。本研究运用环境DNA宏条形码技术探讨鄱阳湖不同的环境样本类型如何影响物种的可检测性，为进行环境DNA监测时取样策略的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理

本研究于2020年1月在鄱阳湖水域进行采样，共设置10个采样点。在每个采样点用采水器采集1L上层水于无菌的可密封广口瓶中，且每个样点做3次重复采样。用采泥器在采水样的地点同时采集沉积物于30 mL无菌密封广口瓶中，每个样点做3次重复采样。所有的样品冰上保存。环境水样于24 h之内用0.45 μm的混合纤维素酯膜滤膜及Rocker 300无油真空泵抽滤。每次过滤前后，均对实验器材进行消毒清洗，避免交叉污染。每次过滤用蒸馏水做阴性对照，以评估外源DNA污染是否存在。在每份水样过滤后，滤膜立即冷冻保存。

1.2 环境DNA提取及扩增

使用试剂盒DNeasy® Blood &Tissue Kit(Qiagen®)提取滤膜中的水样环境DNA(步骤做了适当优化)。使用DNeasy® PowerSoil Kit(Qiagen®)提取沉积物DNA。每个样点做的3次重复，合并DNA。用Qubit(Thermo Fisher Scientific)测试DNA浓度。利用线粒体细胞色素b简并引物L14912-CYB：5’-TTCCTAGCCATACAYTAYAC-3’(Y=C或T)，下游引物H15149-CYB：5’-GGTGGCKCCTCAGAAGACATTTGKCCYCA-3’(K=G或T，Y=C或T)进行PCR扩增，产物大小约285 bp[18]。PCR反应体系为25 μL：5×buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol)2 μL,加标记的上、下游引物(10 uMol)各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 13.75 μL，Q5 DNA Polymerase(2 U/μL)0.25 μL。PCR程序：98℃ 预变性2 min；98℃变性15 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，共30个循环；72℃再延伸5 min；10℃保存。每次PCR均设置阴性对照。每个样本做3次重复PCR，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测。由上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序。

1.3 文库构建、高通量测序、OUT划分及注释

对纯化后的PCR产物用Qubit®3.0(Life Invitrogen)进行定量。测序使用Illumina MiSeq(2×300 bp)和MiSeq Reagent Kit v3按照说明来进行。测序策略为Mova-Seq-PE250。测序数据量为每个样本的有效序列约6万条。使用QIIME软件将低质量的序列按照以下条件去除：(1)长度小于150 bp的序列，(2)平均Phred值<20的序列，(3)含有模糊碱基N的序列，(4)含有>8 bp的单核苷酸重复序列等。将获得的高质量序列一致性大于97%的聚类为一个OTUs(operational taxonomic units,OTUs)，从每个OTU选择一个代表性的，再用BLAST与GenBank进行比对，并分配给总分最高的分类单元。从GenBank中下载鄱阳湖流域的118种鱼类线粒体基因组序列构建本地数据库。将OTU代表序列比对到本地库，设置比对参数E-value<10-12，identity≥97%，并综合公司比对的结果。

1.4 数据分析

2 结果

2.1 物种组成分析

本研究通过对20个样本(空白对照在PCR扩增中并未产生目的条带，未进行高通量测序)采用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序，经质控处理后，共得到102万条有效序列，平均长度270bp。按序列相似性≥97%聚类，得到892个OTU。本研究共注释到鱼类7目11科23种(表1)，其中沉积物样本注释到6目10科18种，水样中注释到5目7科13种。沉积物中注释到的鱼类物种数更多。水样和沉积物环境DNA共同注释到8种鱼类(32%)，仅通过沉积物环境DNA注释到10种鱼类(43.48%)，仅通过水样环境DNA注释到5种鱼类(27.14%)。本研究注释到的鱼以小型、湖泊定居型、杂食性鱼类为主。沉积物样本中注释到的鱼类有6种上层鱼、1种下层鱼和11种底层鱼，水体样本中注释到的鱼类有6种上层鱼、3种下层鱼和4种底层鱼。

表1 环境DNA水样及沉积物监测的鄱阳湖鱼类物种

2.2 Alpha多样性分析

Chao1指数，沉积物的平均值为4.6(变幅2～9)，水体的平均值为3.6(变幅为1～7)。Shannon-Weiner指数，沉积物的平均值为0.80(变幅为0.03～1.59)，水样的平均值为0.50(变幅为0～1.31)。Simpson指数，沉积物的平均值0.29(变幅为0.01～0.59)，水样的平均值为0.22(变幅为0～0.47)。Pielou指数，沉积物的平均值为0.59(变幅为0.04～1.07)，水样的平均值为0.40(变幅为0～1.32)。由图1可知，沉积物的4种多样性指数均高于水样的，但两者之间无显著性差异。

图1 沉积物和水样样本注释到鱼类的多样性指数

2.3 Beta多样性分析

环境DNA方法沉积物与水样在鱼类群落相似性的NMDS排序在结构相似(stress=0.18)，由分析图表明(图2)，沉积物和水样的样本点距离较近，有重叠区域，通过Adonis分析表明，沉积物和水样的环境DNA注释到的鱼类的群落结构没有显著性差异(R2=0.662，P=0.418)。

图2 沉积物和水样中鉴定的鱼类群落NMDS排序

3 讨论

本研究基于沉积物和水体环境DNA共注释到鄱阳湖的23种鱼中，鲤科鱼类物种数最多(表1)，占比最高(43.5%)，这与传统方法调查得出的结果一致[20]。本研究注释到的鱼按生态类型分，以湖泊定居型，这和杨少荣等得出的结果相类[27]。本研究基于环境DNA宏条形码得出鄱阳湖以小型鱼类为主，这和传统方法研究结果相同[28]。本研究只检测到了四大家鱼中的鳙，而没有检测到青鱼、草鱼、鳊和鲢，原因可能与采样的水层有关，鳙是中上层鱼，青鱼、草鱼和鳊是中下层鱼，而本研究只采了上层水；也可能与引物的通用性和高通量测序的数据量有关。本研究没有对优势鱼类物种即序列数多的鱼类进行讨论，是因为PCR扩增过程中引物会有偏好性。很多研究表明PCR的偏好性是造成环境DNA对某些低丰度物种检测不到和物种生物量估测错误的最主要因素[29]。现有环境DNA分析大多依赖PCR扩增，因此控制和减轻PCR的偏好性是环境DNA对生物多样性监测的主要挑战之一。此外，使用环境DNA浓度估计物种丰度并没有那么简单[30]。因为环境DNA在溪流和河流中随水流顺流而下的过程中可能会发生迁移、稀释、滞留和再悬浮，这使得环境DNA浓度数据的解释更加复杂[31]。一些研究发现环境DNA和生物量之间存在积极但微弱的关系[32]，而其他研究发现根本没有关系[33]。

4 结论

本研究首次使用环境DNA宏条形码技术评估了鄱阳湖不同的环境样本类型如何影响鱼类物种的可检测性。沉积物样本中检测到的鱼类的多样性高于水体中的，在进行环境DNA调查时需要仔细考虑环境样本类型。建议在使用环境DNA进行鱼类资源研究时，取样策略采取沉积物样本和水体样本相结合将会更有意义。中国政府曾经只在长江某些地区的春季鱼类产卵季节禁止捕鱼，但现在已经在长江的关键地区实施了为期10年的全面禁渔。因此，环境DNA宏条形码以其采样非侵入性且分辨率高的优势逐渐地成为水生生物多样性调查的重要补充工具。