miR-1246和NFIB在肝癌组织中的表达及其与肝癌预后的关系

陈孝卫，黄武强，蔡道修

(海南省第二人民医院 肿瘤内科，海南 五指山 572299)

肝癌在50～60岁人群中较常见，以男性居多，转移风险高，预后较差，从病理类型上看，肝细胞癌占比超过80%。肝癌早期缺乏特异性症状，当出现明显症状就诊时，大多已进入中、晚期，错过最佳治疗时机，导致预后差，尽早诊疗是改善预后的关键[1]。既往临床通过病理活检对肝癌进行诊断，检出效果较好，但该方式属于有创操作，可能造成肝癌结节破裂，或诱发大出血，严重时危及生命[2]。B超、CT等虽然有一定诊断价值，但也存在缺陷，例如B超受操作者水平影响较大，CT对弥散性病灶的检出效果欠佳[3]。近年来，研究发现微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)与肿瘤发生有关，它具有促癌或抑癌作用，部分miRNAs能对靶基因表达进行抑制，促进细胞增殖，而部分miRNAs则能下调癌基因表达，阻止细胞恶变[4]。临床可考虑从这方面入手，寻求可靠指标提高肝癌诊疗水平，改善预后。有学者指出miR-1246在肿瘤中发挥了重要作用，它能促进食管癌转移[5]。另有研究认为miR-1246参与了宫颈鳞癌进展，对该病早期诊断有一定价值[6]。这表明miR-1246可能对肿瘤评估有一定作用，但现阶段关于其对肝癌预后的影响尚未明确。还有研究发现核因子I/B(nuclear factor I/B，NFIB)转录因子家族在肿瘤细胞增殖、凋亡过程中具有调节作用[7]。而目前关于NFIB与肝癌的关系也并未明确，基于上述背景，本研究纳入160例肝癌患者进行分析，观察miR-1246、NFIB在肝癌组织中的表达及其与肝癌预后的关系，为改善预后提供思路，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入我院2017年3月至2019年3月收治的肝癌患者160例，均获得癌组织及癌旁组织。纳入标准：经手术病理证实为肝癌，年龄≥18岁；首次诊断者，肝癌病理类型明确；入院后完善相关肝功能、实验室检查；遵循自愿原则，知晓研究内容，签署同意书。排除标准：患其他原发性肿瘤者；术前有新辅助治疗史者；患其他危及生命的疾病如严重心血管、脑血管疾病者；既往有肝部手术史者；患自身免疫性疾病者；凝血功能异常者。其中男89例，女71例，年龄43～72岁，平均(55.92±12.65)岁。临床分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期57例，Ⅲ期71例；饮酒史：有43例，无117例；肝硬化：有36例，无124例；Child-Pugh分级：A级74例，B级86例；肿瘤直径：<5 cm 97例，≥5 cm 63例；肿瘤数目：多发28例，单发132例；慢性肝炎病史：有128例，无32例。研究方案获本院伦理委员会批准。

1.2 检测方法

1.2.1 肝功能指标检测 采集3 ml空腹肘静脉血，以3 000 r·min-1离心10 min，离心半径10 cm，取血清-80 ℃保存待测。采用山东博科生物产业有限公司生产的BK-400型全自动生化分析仪测定血清白蛋白(albumin，ALB)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

1.2.2 NFIB检测 采用免疫组化法检测，主要试剂为NFIB检测试剂、抗原修复液、DAB显色试剂，购于赛默飞世尔科技有限公司。主要仪器为FPMIC-volcano石蜡包埋机(辅光精密仪器有限公司)、XSP-63A荧光显微镜(上海光学仪器一厂)、HHQ组织切片机(杭州艾普仪器设备有限公司)、赛默飞F3系列微量移液器(赛默飞世尔科技有限公司)，免疫组化方法参考说明书。结果判定[8]：所有患者均由相同病理专家切片，若胞质内出现黄色、棕黄色或棕褐色，则提示为阳性，每个切片经高倍镜(×400)取10个视野进行观察。染色程度分值评估：无着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别计0、1、2、3分；阳性细胞占比分值评估：<5%、5%～25%、26%～50%、51%～74%、≥75%分别计0、1、2、3、4分。两种评分乘积为最后分值，<1分为阴性，1～2分弱阳性，3～4分中度阳性，>4分强阳性，阴性、弱阳性即低表达，中度阳性、强阳性即高表达。

1.2.3 miR-1246检测 采用实时逆转录荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)测定miR-1246。主要试剂为蒸馏水、异丙醇、miR-1246检测试剂、氯仿、总RNA提取试剂，购自赛默飞世尔科技有限公司，主要仪器为Lepgen型PCR仪(山东博科生物产业有限公司)、DDL-8R型高速离心机(爱来宝医疗科技有限公司)、Research plus型微量移液器(德国艾本德股份公司)。根据Trizol法对总RNA进行提取，并测定其纯度、浓度，将RNA逆转录成cDNA，行PCR检测，引物序列如下：(1)miR-1246上游、下游序列分别为5′-TCCCAATGGTTTTTGGAGCAGGTCAAGAGCCTGCTCCAAAAACCATTTTT-3′、5′-CAAAAAAAATGGTTTTTGGAGCAGGCTCTTGACCTGCTCCAAAAACCATTT-3′；(2)内参引物U6上游、下游序列分别为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′、5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反应条件：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，40个循环。采用2-ΔΔCT表示miR-1246表达量。

1.3 亚分组方法

以肝癌患者癌组织中miR-1246表达量均值为界，将其分成高表达组(miR-1246≥均值)和低表达组(miR-1246<均值)；根据NFIB表达强度分成高表达组与低表达组，分析二者与病理特征的关系。

1.4 随访分析

以患者术后随访24个月为随访截止时间，在患者出院后通过电话、微信等方式随访，记录累积生存率，将生存者纳入生存组，死亡者纳入死亡组。

1.5 统计学处理

采用SPSS20.0软件行数据分析。计数资料用百分比(%)表示，行χ2检验；计量资料以均数±标准差表示，两组比较行独立样本t检验。采用Cox多元回归模型分析预后的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝癌组织、癌旁组织中miR- 1246、NFIB表达比较

肝癌组织中miR-1246表达量为(61.24±9.96)，高于癌旁组织的(12.53±3.36)(t=58.616，P<0.05)。肝癌组织中NFIB高表达率为40.00%(64/160)，高于癌旁组织的8.13%(13/160)(χ2=44.483，P<0.05)。免疫组化结果见图1。

A.肝癌组织；B.癌旁组织

2.2 肝癌患者miR- 1246表达与临床病理特征的关系

miR-1246高表达组83例，低表达组77例。miR-1246高表达组临床分期Ⅲ期、肿瘤直径≥5 cm、多发性肿瘤占比分别为49.40%(41/83)、49.40%(41/83)、26.51%(22/83)，高于低表达组的38.96%(30/77)、28.57%(22/77)、7.79%(6/77)(P<0.05)，见表1。

表1 肝癌患者miR-1246表达与临床病理特征的关系 例

2.3 肝癌患者NFIB表达与临床病理特征的关系

NFIB高表达组临床分期Ⅲ期、肿瘤直径≥5 cm、多发性肿瘤、ALT>40 U·L-1占比分别为57.81%(37/64)、54.69%(35/64)、28.13%(18/64)、78.13%(50/64)，高于低表达组的35.42%(34/96)、29.17%(28/96)、10.42%(10/96)、56.25%(54/96)(P<0.05)，见表2。

表2 肝癌患者NFIB表达与临床病理特征的关系 例

2.4 不同预后肝癌患者的miR- 1246、NFIB表达比较

生存组miR-1246、NFIB高表达率均低于死亡组(P<0.05)，见表3。

表3 不同预后肝癌患者的mi 1246、NFIB表达比较

2.5 肝癌患者预后的Cox单因素与多因素分析

以年龄(<60岁=0，≥60岁=1)、临床分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2)、肝硬化(无=0，有=1)、肿瘤直径(<5 cm=0，≥5 cm=1)、肿瘤数目(单发=0，多发=1)、miR-1246表达(低表达=0，高表达=1)、NFIB表达(低表达=0，高表达=1)为自变量X，以预后为因变量Y(生存=0，死亡=1)，经Cox多因素分析提示，临床分期Ⅲ期、肿瘤直径≥5 cm、多发性肿瘤以及miR-1246、NFIB高表达是预后危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 肝癌患者预后的Cox单因素与多因素分析

3 讨 论

肝癌多因慢性肝炎所致，主要为丙型肝炎、乙型肝炎，发病机制较复杂，还可能与过量饮酒、黄曲霉素等因素相关[9]。目前，临床针对肝癌已有多种干预方式，例如根治性手术、靶向药物、放疗、化疗等，然而5年生存率仍较低，即便患者早期行根治手术治疗，5年生存率也不足80%，且部分患者术后甚至出现并发症，影响手术疗效[10]。因此，临床须寻求一种有效的诊疗方法，为肝癌治疗提供依据，使患者生存时间延长。舒耀等[11]发现miR-1246在乳腺癌中具有促癌基因作用，参与了乳腺癌发病、进展过程。Salah等[12]研究显示，miR-1246参与了大肠癌的进展，对大肠癌诊断有一定价值。另有研究认为，NFIB与肿瘤发生也密切相关，它可能通过对乳腺癌患者雌激素反应进行调节，促进乳腺癌进展[13]。上述研究提示，miRNA-1246、NFIB可能与肿瘤进展有关。本研究考虑从二者入手，进一步分析二者与肝癌之间的关系，为改善肝癌预后提供可靠依据。

本研究结果显示，肝癌组织中miR-1246表达量、NFIB高表达率高于癌旁组织，提示二者可能与肝癌发生有关。miR-1246是微小分子RNA的一员，它在多种肿瘤中具有促癌作用，例如宫颈癌、乳腺癌等[14-15]。Bhagirath等[16]研究指出，miR-1246表达增高是侵袭性前列腺癌的标志物，对前列腺癌进展有促进作用，且与患者临床分级增高有关。由此可见，miR-1246在肿瘤疾病中存在异常表达。研究表明在细胞受损情况下，p53基因对miR-1246表达存在诱导作用，能对细胞凋亡进行抑制，促进细胞增殖，导致肿瘤进展，这可能是miR-1246促癌作用的机制之一[17]。NFIB在细胞分化中有调节作用，它可通过基因融合参与恶性肿瘤发生，在肺癌中有致癌功能，机体的肿瘤环境可能导致NFIB所介导的癌症侵袭性进展[18]。Becker-Santos等[19]对肺癌患者进行研究发现，NFIB参与了肺癌进展，能提高肿瘤侵袭性。研究表明沉默NFIB基因可抑制肿瘤细胞增殖，并激活细胞凋亡通路[20]。这提示NFIB表达降低可抑制肿瘤进展，进一步证实其参与了肿瘤发生。本研究结果显示，肝癌患者miR-1246、NFIB高表达均与临床分期、肿瘤直径、肿瘤数目存在关联。临床分期越高表明肿瘤恶性程度越高，肿瘤直径越大则可能导致周围组织受累程度更重，而多发性肿瘤也容易增加组织波及范围，促进肝癌进展，在这过程中，miR-1246、NFIB高表达可能发挥了促癌基因作用，导致肿瘤恶性程度加重，或促进肿瘤细胞增殖，扩大受损范围。本研究还发现NFIB高表达可能与ALT水平有关，这表明NFIB高表达可能加重肝癌患者的肝脏受损程度。

miR-1246、NFIB参与了肝癌进展，并且影响其预后。本研究结果显示，生存组miR-1246、NFIB高表达率较死亡组降低，表明二者高表达会增加死亡风险。miR-1246能通过与靶5′非翻译区、3′非翻译区结合，或者与编码区结合，调节靶基因翻译、转录水平，参与肿瘤细胞凋亡、分化等过程，从而参与肿瘤进展[21]。而NFIB则可能通过调节蛋白激酶B/信号转导子和转录激活子3轴参与肿瘤进展，对肿瘤预后也有较大影响[22]。二者在肝癌中均具有促癌作用，导致死亡风险增高。本研究结果结果还显示，miR-1246、NFIB高表达是预后危险因素，进一步证实二者与患者预后密切相关。既往有学者发现miR-1246表达上调能增加肿瘤转移、复发风险[23]。这表明miR-1246可能通过促进肿瘤转移、复发影响预后，本研究与之一致。NFIB也可通过发挥促癌作用导致肝癌进展，增加预后不良风险。二者可能相互作用，共同影响肝癌患者病情与预后。本研究提示肝癌预后还与年龄、临床分期、肝硬化、肿瘤直径以及肿瘤数目有关，与既往结论[24-25]吻合。在日后的肝癌治疗中，临床可将miR-1246、NFIB作为新的治疗靶点，通过下调二者水平改善肝癌预后。

综上所述，肝癌组织中miR-1246表达量明显增高，且NFIB高表达率高于癌旁组织，二者均为患者预后的影响因素。本研究局限性为随访时间较短，未分析miR-1246、NFIB对肝癌远期预后的影响，未来还需延长随访时间予以探讨。