儿童急性中耳炎金黄色葡萄球菌抗生素耐药性与分子遗传背景特征分析△

周龙平 唐向荣 傅锦坚

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)是导致各种人群发生社区获得性感染或医院获得性感染的主要病原体之一[1,2]。SA可在全球播散蔓延得益于其具有特异性的基因，这些基因编码的蛋白可锚定在健康个体或患者的呼吸系统或其他上皮和黏膜的表面，是造成SA发生传播和感染的分子基础[3,4]。此外，SA对多种抗生素产生耐药性，促进了在抗生素选择性压力下的多重耐药性SA菌株的选择性生长和繁衍，进而在社区和医疗机构超级传播，对公众健康构成严重威胁[5]。根据耐甲氧西林金葡菌( methicillin-resistant SA,MRSA)其分子决定物和对抗生素的耐药性不同，研究者进一步将MRSA细分为社区获得性MRSA(community acquired MRSA)和医院获得性MRSA(hospital acquired MRSA)，这些MRSA连同甲氧西林敏感性SA(methicillin-sensitive SA，MSSA)是导致儿童发生急性中耳炎的主要致病病原体[6]。此外，有研究显示，葡萄球菌肠毒素可能参与慢性炎性疾病(如慢性中耳炎)的发病机理，但关于儿童SA中耳炎的分子流行病学报道不多。本研究从急性中耳炎儿童患者的中耳脓液或分泌物中分离出了SA菌株，并进一步进行了分子特征的研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1研究对象和样本收集 以2018年1月至2020年6月在柳州市妇幼保健院(城中总院和柳东分院)耳鼻喉科门诊和住院被诊断为急性中耳炎(AOM)的150例患儿为研究对象。纳入标准：年龄小于18岁且符合AOM的诊断标准， AOM的诊断标准基于《国际疾病分类》第九版，临床修改(ICD-9-CM)代码3810、3820或3829[6]。任何被诊断慢性中耳炎或有鼓膜置管术、胆脂瘤或外耳道炎既往史的儿童均被排除在外、非深耳道的自发性脓液或分泌物的培养结果亦排除。由耳鼻喉科医生取每例患儿深耳道的自发性脓液或分泌物，若双耳均有脓液，则合并样本送至医学检验科微生物检验实验室进行细菌培养和鉴定。所有细菌培养结果以首次结果为准，纳入非重复性样本进行后续研究。上述研究获得柳州市妇幼保健院伦理委员会的批准。

1.2SA的分离鉴定 收到标本的半小时内将样本接种于含5%羊血的哥伦比亚琼脂平板、嗜血巧克力和麦康凯平板，置于含有5%二氧化碳培养箱中37℃培养18～24小时，挑选可疑阳性菌落进行革兰染色、形态学等鉴定，纯化后上机鉴定相关病原体，本研究仅关注分离鉴定出来的SA菌株。所有的琼脂平板购自郑州安图生物公司，仪器选择生物梅里埃的VITEK 2 COMPACT，鉴定卡片为AST-GP卡。

1.3药物敏感试验和耐药基因检测 使用生物梅里埃的VITEK 2 COMPACT，药敏卡片为 AST-GP67卡，对SA菌株进行药物敏感试验，检验结果的读取基于美国临床与实验室标准化委员会(CLSI)提出的标准执行。多重耐药的判定标准为菌株对≥3种不同型别的抗生素产生耐药。此外， 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)方法用于检测四环素耐药基因(tetM和tetK)、大环内酯类耐药基因(ermA和ermC)、反映甲氧西林耐药的基因mecA和甲氧西林耐药突变基因A(femA)[6]。

1.4SA的分子特征分析 采用多序列基因分型(multilocus sequence typing，MLST)方法对SA的7个管家基因进行测序后，将测序结果通过MLST的数据库(http://eburst.mlst.net)查询得出序列分型(ST)和等位基因。使用网站自带程序eBURST确定特定ST的克隆复合体(CC)；使用PCR方法对具体的mecA基因进行分型[7]；使用PCR法对SA菌株的10种毒素基因进行检测；对杀白细胞素(pvl)、免疫逃逸簇基因(immune evasion cluster，IEC)(scn、chp、sak、sea和 sep)、肠毒素基因(seb、sec、sed、seg、seh、sei、sej、sek、sem、sen、seo、seq和seu)、溶血素基因(hla、hlb和hld)和中毒性休克综合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin 1，tsst-1)进行检测[6～8]。耐药基因和毒力基因的检测在柳州市妇幼保健院医学遗传科完成。采用MLST方法，对7个管家基因进行PCR扩增后，将产物送至上海生工进行测序，由本课题组成员对测序结果进行比对分析。

1.5统计学方法 使用SPSS软件对数据进行统计学分析。等级变量和率的差异采用χ2检验或Fisher’s精确检验，患儿年龄的比较使用t检验，对金葡菌CC与抗生素耐药谱模型(敏感、非多重耐药和多重耐药)以及CC与每株菌株携带的毒力基因的数量(1～4个、5～7个和8～13个)采用对应分析，结果以χ2检验值表示，所有的检验结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1AOM儿童SA感染的抗生素耐药表型、基因型和毒力基因特征分析 150例患儿中，共从86份非重复的标本中检出SA，其中男童41例(47.7%)，女童45例(52.3%)，年龄分别为1.31±0.16岁和1.45±0.98岁，两组比较差异无统计学意义(t=-0.43，P=0.671)。86例中，检出MRSA 20例，MSSA 66例，其中55株SA菌株至少对三种抗生素产生耐药状态，多重耐药率为63.95%(155/86)。与MSSA相比，MRSA对红霉素和克林霉素的耐药率更高(P<0.05)，而MSSA比MRSA更容易对环丙沙星和庆大霉素产生耐药(P<0.05)。MRSA菌株携带的耐红霉素基因ermC和耐四环素基因tetK的检出率均显著高于MSSA菌株(P<0.05)；同时，MRSA菌株携带的免疫逃逸簇基因(scn、chp和sak)、肠毒素基因(seb和sek)、溶血素基因hlb以及杀白细胞素基因(pvl)的检出率均显著高于MSSA菌株(P值<0.05)。MSSA菌株携带的肠毒素基因sem和中毒性休克综合征毒素-1(tsst-1)的检出率均显著高于MRSA(分别为P=0.002和P<0.001)(表1)。所有86株SA均对万古霉素、利奈唑胺敏感，未能检出耐药基因ermA、tetM和肠毒素基因seq。

表1 抗生素及耐药基因型、毒力基因在SA、MRSA与MSSA菌株分布(例，%)

2.2AOM的SA样本克隆复合体耐药谱、耐药基因谱和毒力基因谱 20株MRSA菌株均携带SCCmecIVa，且均属于CC59(其中ST59和ST338各10株)，表明此20株MRSA均为CA-MRSA菌株。8株菌株中共检测出12种ST型别，分别属于9种CC和1种未能分类的CC，其携带的耐药基因谱、毒力基因谱以及抗生素耐药谱结果见表2。可见，不同的CC和ST型别，其耐药谱不一致，经过对克隆复合体与耐药谱(分为敏感、非多重耐药和多重耐药)进行对应分析，结果表明，CC与特定的耐药谱对应具有差异性，表明SA的分子遗传背景不同，其对抗生素的耐药谱亦不一致(χ2=131.11，P<0.001)(图1)。进一步将SA菌株携带的毒力基因数量分为3组(携带1～4个、5～7个和8～13个毒力基因)进行对应分析，结果发现SA的分子遗传背景不同，其携带的毒力基因数量亦不一致(χ2=159.79，P<0.001)(图2)。

3 讨论

咽鼓管功能障碍和细菌感染是导致中耳炎发生的主要原因，金黄色葡萄球菌是最常见的致病病原体之一[9]。积极监测和分析细菌的种群结构和流行动态是成功控制细菌克隆传播的重要因素，尤其是对于快速生长繁殖的细菌，如：金黄色葡萄球菌等。因而，本研究主要从致中耳炎的金黄色葡萄球菌抗生素耐药性、耐药基因、毒力基因和MLST分型方面进行综合分析。

抗生素药物敏感性主要用于指导临床精准用药，但临床医师在诊治中耳炎时，大部分选择了经验用药，针对中耳炎的抗生素处方多为头孢类抗生素。本研究结果显示，导致中耳炎的金黄色葡萄球菌主要为MSSA(占75.0%)，且SA菌株对头孢曲松的耐药率为20.9%，主要体现在对特定的克隆复合体，耐药模式亦较为固定，如：对头孢曲松耐药的主要MRSA菌株为ST338，而MSSA菌株主要为ST2633、ST657、ST25和ST188。本研究中所有的菌株对利奈唑胺和万古霉素敏感，对左氧氟沙星的耐药率为16.3%；由于临床常用氧氟沙星滴剂作为中耳炎的经验用药，表明临床上仍可将该类药物作为经验用药的备选药物。

对SA菌株进行分子特征分析可拓宽临床医师对金黄色葡萄球菌潜在传播机制的认识。本研究结果显示，最常见的SA基因型为CC59(ST59和ST338)、CC5、CC6和CC398，其中CC59(ST59和ST338)是主要的MRSA菌株，与我国Liang等[10]和Wang等[11]的研究结果类似，但与德国和美国的报道不太一致。德国最为流行的SA克隆复合体为CC15、CC8、CC25和CC7[12]；美国最为流行的SA克隆复合体为CC30、CC5和CC8[13]，表明金黄色葡萄球菌的流行存在地域性分布的差异。本研究检出的ST338和ST59是最为流行的MRSA菌株，与广州的报道[10]相似，被认为是主要的宿主适应性谱系。此外，本研究检出最多的MSSA菌株是CC398、CC5和CC6，ST398此前一直被认为是动物感染相关的SA菌株，在人类样本中较少发现，但最近几年人源性ST398感染的报道一直在增加，如：日本三甲医院检出ST398[14]，美国俄亥俄州学校操场中检出ST398[15]；本研究从86株SA菌株中检出16株ST398菌株，表明ST398菌株导致的SA感染疾病一直在增加，尤其是在儿童群体中，这些发现也许可以揭示ST398从环境(学校操场)到儿童群体传播的分子生物学证据。

研究细菌的耐药表型与遗传背景特征之间的潜在关系可以揭示更多的SA感染传播的证据。本研究采用的对应分析结果表明，SA克隆复合体与菌株的耐药模式或毒力基因数量之间存在显著的对应关系，如CC5、CC59、CC121和CC398菌株主要与多重耐药相关；CC121和CC188主要携带1～4种毒力基因，CC59、CC88和CC25主要携带8～13种基因等；CC59、CC398和CC88主要携带pvl基因，而tsst-1基因主要在CC5和CC88分离株中发现；揭示了基于多种表型-基因型特征区分金黄色葡萄球菌克隆的必要性，这为监测新的流行病学趋势提供了新思路。

本研究结果表明导致急性中耳炎的金黄色葡萄球菌大多呈现多重耐药状态；通过对应分析，发现金黄色葡萄球菌特定的分子遗传背景(CC)与抗生素耐药表型与毒力基因型之间存在着显著的对应关系，不同的SA菌株、不同的克隆复合体的耐药表型和携带的毒力基因均不一致；为基于多种表型-基因型特征区分金黄色葡萄球菌感染的致病性提供了新的研究思路。