大鼠功能性下颌前伸后髁突软骨骨化前后PLC-γ1的变化研究

盛海莹，王秋锐，尉 静，关秀娟，赵利霞，左艳萍*

(1.北京市通州区新华医院口腔正畸科，北京 101100；2.河北医科大学第一医院口腔正畸科，河北 石家庄 050031)

功能性下颌前伸后髁突后部软骨细胞增殖，但软骨细胞向骨细胞转化的机制尚不明确。已证实下颌骨髁状突骨改建受多种内源性调节因子的影响，包括骨形态发生蛋白、X型胶原Sox-9、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、核因子κB 受体活化因子配基、基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP) -2 、MMP-9、牙本质基质蛋白1、整合素β等[1-3]。这些调控因子并不是独立存在的，而是与组织细胞内许多相关因子联合发挥作用，其中血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)是细胞膜上的大分子跨膜蛋白，能接收外界信号，其下游的信号因子磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1，PLC-γ1)在肿瘤细胞、卵母细胞、牙周膜细胞等细胞的分裂增殖信号转导过程中发挥着关键作用,因此，PLC-γ1在许多疾病临床治疗中成为重要靶点[4-8]。那么PLC-γ1是否对软骨细胞分裂、增殖有调控作用呢？其在下颌功能性前伸后髁突软骨骨化过程中扮演了一个什么角色？本研究采用免疫组织化学染色方法检测PLC-γ1在大鼠功能性下颌前伸前后髁突软骨后部表达水平的变化，探讨 PLC-γ1在功能性下颌前伸后大鼠髁突后部软骨骨化过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验设计 60只4周龄健康雄性SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠(河北医科大学动物实验中心提供)，平均体重90 g。于河北医科大学第一医院中心实验室(室温约26 ℃)适应性饲养1周后，将大鼠随机等量分为2组，实验组大鼠24 h/d佩戴自制斜面导板矫治器，对照组不作任何处理。于实验第1、3、7、14、21、28 天时2组采用断颈法各处死5只。

1.2组织处理 大鼠处死后，尽快取出双侧整块颞下颌关节，注意避免损伤关节囊。4%多聚甲醛 (0.1 mol/L PBS，pH 7.0～7.6，含0.1%焦磷酸二乙酯)固定24 h，10%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)室温脱钙2周(用大头针针刺组织无阻力进入表示脱钙成功)，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，包埋时尽量保证髁突矢状面与蜡块表面平行。髁突纵向切片，厚度约5 μm，将组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60 ℃过夜。

1.2.1HE染色 切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精下行水化，苏木素染色，1%盐酸酒精分化数秒，1/500氨水中返蓝，0.5%伊红染色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.2免疫组织化学分析 切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇置换二甲苯，1%甲醇过氧化氢消除内源性过氧化物酶，枸橼酸盐抗原修复液进行抗原修复，滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min。弃去多余液体,不洗。滴加一抗 (anti-PhosPho-PLC-γ1，兔多抗，assay公司，美国)，4 ℃过夜。按免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)要求滴加生物素化第二抗体(IgG)， 37 ℃ 20 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，PBS冲洗。3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)显色，苏木素复染细胞核。空白对照：PBS代替一抗。

1.3图像分析 应用光学显微镜(BX51TPHD-J11，奥林巴斯公司，日本)多功能真彩色细胞图像分析管理系统采集40倍及400倍HE染色切片图像，对髁突软骨后部免疫组织化学染色切片，随机选择3个视野，采集400倍图像，统计阳性细胞数和着色强度，取平均值，结果用强度-色调-饱和度(intensity-hue-saturation，IHS)值表示，计算公式为IHS=A×B。其中A表示阳性细胞数，取值范围：0为0%，1为1%～10%,2为11%～50%，3为51%～80%，4为81%～100%；B表示着色强度，0为阴性，1为弱阳性，2为阳性，3为强阳性。

1.4统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料组间比较采用独立样本的t检验，时点间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1HE染色结果 髁突软骨厚度由后向前逐渐变薄，从软骨表面向内部分为5层，分别是表面纤维层、增殖层、过渡层、肥大层、钙化软骨层，各层细胞形态特征不同，层带之间相互延续，软骨下方为骨小梁，与软骨的钙化软骨层相延续(图1，2)。

2.2免疫组织化学染色结果 细胞质内PLC-γ1表现为阳性着色，DAB显色棕黄色，着色水平明显高于背景水平，主要表达于髁突软骨的增殖层和过渡层。实验组第14天时表达最强(图3～6)。 空白对照组：PBS代替一抗组细胞质未见阳性着色颗粒(图7)。

2.3IHS值统计结果 第7、14、21、28 天时实验组髁突软骨后部PLC-γ1表达的IHS值高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；2组不同时间点PLC-γ1表达的IHS值差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组大鼠髁突软骨后部PLC-γ1表达情况(IHS值)比较Table 1 The PLC-γ1 expression(IHS value) in the posterior condylar cartilage between two groups

Figure 2 The morphological characteristics of condyle cartilage of rats (×400)

3 讨 论

本研究HE染色结果显示，髁突软骨后部增厚明显，由后向前髁突软骨厚度逐渐变薄，提示髁突后部发生了较为明显的骨改建，与前人实验研究结果一致[9-10]，因此选择髁突软骨后部进行免疫组织化学染色研究。

目前研究发现，PLC-γ1上游信号因子之一是VEGF及其受体VEGFR-2，早期研究发现VEGF是一种内皮系统组织细胞的特异性因子，在动物胚胎期血管发生过程中起着重要作用[11]。现研究证实，非内皮系统组织中也广泛存在VEGF，VEGF与骨形成蛋白具有相似的功能，在软骨成骨过程中协调着软骨细胞增殖与骨形成之间的关系，在软骨细胞转换为骨细胞的过程中起着重要作用[12-14]。研究发现，VEGF在小鼠软骨骨化的早期和晚期都发挥了重要作用，将小鼠VEGF基因敲除后其软骨骨化过程受阻[15]。近年来研究发现，VEGF及其受体VEGFR-2在髁突软骨的骨改建过程中同样发挥着不可或缺的作，有学者在大鼠髁突和颞骨关节窝中检测到了VEGF，提出骨取代软骨的标志是软骨细胞表达VEGF刺激新生血管形成，VEGF是连接血管和新骨形成的重要因子[16]。将生长发育期SD大鼠采用功能矫治器导致下颌前伸后可刺激髁突软骨发生适应性改建，增强软骨细胞的增殖活性，使其分化加速，VEGFR-2作为 VEGF 的特异性受体，介导了 VEGF生物学作用，参与了大鼠髁突软骨的骨改建[17]。髁突软骨细胞分泌VEGF有的通过自分泌方式，有的通过旁分泌方式，VEGF与其受体VEGFR-2作用诱导软骨细胞肥大层内的血管化进程，促进软骨骨化[18]。

哺乳动物体内广泛存在PLC-γ1，其一般位于细胞质内，当细胞处于静止状态时PLC-γ1通常维持在一定水平，而当机体组织接收到外界刺激，例如细胞内的大分子调控因子VEGF将外界刺激信号进一步传递到细胞内，接收到上一级信号刺激后，PLC-γ1的酪氨酸磷酸化位点被激活，从而促进组织细胞的分裂、增殖、分化等过程[14，19]。其具体过程如下：VEGF接收到外界信号刺激后，进一步作用于细胞膜上的受体VEGFR-2，将细胞膜上受体蛋白的酪氨酸残基激活，而这些受体又具有酪氨酸激酶活性，当PLC-γ1 与活化的生长因子受体结合后，受体本身的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)发生自动磷酸化后被激活，与胞内PLC-γ1的SH2、SH3结构域结合并将其酪氨酸残基激活，从而进一步激活细胞内一系列下游信号传导通路。PLC-γ1的SH2与PTK结合后，作用于细胞膜上的磷脂酰肌醇4，5二磷酸并将其分解为二酰甘油(diacylglycerol,DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)。DAG可激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，IP3可引起细胞内钙库释放钙离子，最终完成细胞内信号的传递，引发细胞的增殖与分化[20]。VEGFR2是VEGF的主要功能受体,已有5个主要的磷酸化位点被证实，其中Tyr-1175、Tyr-801是PLC-γ1结合位点[21]。PLC-γ1-Tyr783的磷酸化激活PLC-γ1的活性，在调控血管内皮细胞促进血管新生方面发挥了重要作用。胚胎期动脉血管的发生即通过VEGFR2的Tyr-1175被激活后,进一步激活胞内的PLC-γ1来完成[22]。Husain等[23]研究发现，VEGFR-2能够通过PLC-γ1 信号的活化促进内皮细胞的增殖效应。

VEGF-VEGFR-2-PLC-γ1信号链在血管生成过程中发挥了重要作用,那么该信号链是否在下颌髁突前伸后软骨骨化过程中同样发挥作用？本研究结果显示，第7、14、21、28 天时实验组髁突软骨后部PLC-γ1表达的IHS值高于对照组，与前人关于VEGF及其受体VEGFR-2在大鼠功能性下颌前伸后髁突软骨后部的表达变化规律具有一致性[24]。已经证实VEGF在大鼠下颌功能前伸后髁突软骨后部软骨成骨过程中发挥了一定作用[25]，因此，推测VEGF-VEGFR-2-PLC-γ1这条信号通路在功能性下颌前伸大鼠髁突软骨骨化过程中发挥了一定作用。

下颌功能前伸后髁突软骨改建是个复杂的过程，PLC-γ1和VEGF在软骨骨化过程中具体机制尚未明确，本研究仅通过PLC-γ1的表达情况与前人关于VEGF及其受体VEGFR-2的表达具有一致性来推测该信号链在大鼠下颌功能前伸后髁突软骨骨化过程中发挥作用尚不全面，这是本研究的不足之处，如引入PLC-γ1及VEGF的抑制剂从对立面进一步证实则可信度更高。但可以肯定的是PLC-γ1是众多细胞因子信号途径的交汇，在组织反应的信号转导过程中是一个关键节点，PLC-γ1可能参与了下颌功能性前伸大鼠髁突软骨骨化的过程，对其水平进行检测对髁突部软骨骨化的研究具有重要参考价值，相信其在口腔领域也将会为功能矫治骨骼改建靶点选择提供参考。