潜阳育阴颗粒对自发性高血压大鼠肾脏足细胞损伤的影响及其机制研究

李婕，马思齐，许骏尧，郑亚威，王艺璇，李海涛

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；3.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210023)

高血压是影响全世界10亿多人的重大公共卫生挑战,是造成全球发病率和死亡率的主要因素之一[1]。2012年至2015年的调查显示,23.2%的18岁以上的中国人(即约2.445亿人)患有高血压,而41.3%的人(即约4.353亿人)处于高血压前期状态[2]。从长远来看,高血压会增加心力衰竭、脑卒中、视力丧失和慢性肾脏病等的风险[3]。肾脏是高血压损伤的主要靶器官之一,在血压长期控制不良的情况下,可逐渐发生广泛的肾小动脉与肾小球硬化,导致肾功能损害,最终进展为终末期肾病[4]。

足细胞,又称为肾小球上皮细胞,位于肾小球外侧并覆盖毛细血管壁,在肾脏的肾小球滤过中起重要作用[5]。高血压的发生激活了局部组织血管紧张素系统,从而增加了血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)的产生,导致足细胞损伤等不良反应[6]。研究表明,足细胞损伤在高血压肾损害进展中起着重要作用。

在高血压肾损害的治疗中,中医药具有多靶点、多层次、多环节的优势,在实现降压效果的同时保护肾脏。潜阳育阴颗粒(QYYY)针对高血压肾损害“肝阳亢盛、肝肾阴虚、瘀阻肾络”的病机特点,由鬼针草、制何首乌、酒萸肉、玄参、川牛膝、泽泻6味药物制成[7],具有清肝补肾、化瘀通络作用,已作为江苏省中医院院内制剂广泛应用于临床20余年,疗效确著。前期研究发现,QYYY可以辅助降压并改善阴虚阳亢型高血压的炎症反应,改善尿蛋白、尿微量白蛋白等早期肾损害指标[8-9]。本研究主要探究QYYY对高血压足细胞损伤的改善作用。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR)50只,8～9周龄;SPF级Wistar Kyoto(WKY)雄性大鼠10只,8～9周龄。均购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0006。SPF级SD雄性大鼠42只,8～9周龄,购于杭州医学院,许可证号:SCXK(浙)2019-0002。实验动物均饲养于江苏省中医院制剂部动物实验中心,饲养温度23～25 ℃,湿度40%～70%。所有动物均适应性饲养1周。实验经南京中医药大学附属医院实验动物伦理委员会审批，伦理批号：2019 DW-07-02。

1.2 细胞

大鼠足细胞ZY-907,购自上海泽叶生物科技有限公司。

1.3 药物与试剂

QYYY,由江苏省中医院制剂部生产,批号:2103010。缬沙坦胶囊,北京诺华制药有限公司生产,批号:X2998。

Ang Ⅱ(货号：A9525),购自美国Sigma。Anti-TRPC6 antibody(货号：ab101622)、Anti-Nephrin antibody(货号：ab216341)购自Abcam。Anti-Desmin Antibody(货号：16520-1-AP)、Anti-NPHS2 Antibody(货号：20384-1-AP)、Anti-GAPDH Antibody(货号：60004-1-Ig),购自武汉三鹰生物技术有限公司。

2 方法

2.1 动物实验分组及给药

实验分为6组,分别是空白组、模型组、潜阳育阴低剂量组(QYYYL)、潜阳育阴中剂量组(QYYYM)、潜阳育阴高剂量组(QYYYH)、阳性药组。空白组为10只WKY大鼠,将SHR随机分为5组,每组10只,各组大鼠均自由摄食摄水。QYYYL、QYYYM、QYYYH分别以1.6、3.2、6.4 g·kg-1·d-1灌以QYYY混悬液,阳性药组以8.5 mg·kg-1·d-1灌以缬沙坦混悬液。空白组和模型组每日灌胃生理盐水,每日1次,持续8周。根据大鼠体质量调整药量。实验结束当天，大鼠药物干预1 h后，腹腔注射0.3%戊巴比妥麻醉，于后腹腔切取两侧肾脏组织。将一侧肾脏皮质分成两份，分别用锡箔纸包好置于冻存管中，-80 ℃保存。另切取约10 mm×10 mm×2 mm大小的肾脏组织，置于多聚甲醛固定液中固定，用于后续制作切片进行HE染色和Masson染色。

2.2 HE染色观察QYYY对SHR肾脏的影响

取大鼠肾脏组织，用4%的多聚甲醛固定,石蜡包埋后切片,二甲苯脱蜡,再经由高浓度到低浓度乙醇,最后入蒸馏水,切片放入苏木素水溶液中染色5 min,分化液分化20 s,双蒸水冲洗,伊红染色液染色3 min,双蒸水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明2次,最后中性树胶封固。

2.3 Masson染色观察QYYY对SHR肾脏的影响

将各组织的石蜡切片脱蜡脱水,用配置好的Weigert铁苏木素染液染色5 min,酸性乙醇分化液分化10 s,双蒸水冲洗,Masson蓝化液返蓝5 min,双蒸水冲洗,丽春红品红染色液染色5 min,弱酸工作液(蒸馏水∶弱酸溶液=2∶1)清洗1 min,磷钼酸溶液洗1 min,再用弱酸工作液清洗1 min,直接放入苯胺蓝色液中染色2 min,弱酸工作液洗1 min,95%乙醇脱水二甲苯透明3次,每次1 min,中性树胶封固。

2.4 MTT法测定不同浓度Ang Ⅱ对大鼠足细胞的损伤程度

将大鼠足细胞接种于96孔板内,使用不同浓度(1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol·L-1)Ang Ⅱ的培养基干预足细胞24 h。每孔加20 μL MTT,37 ℃培养4 h,离心,吸去上清,每孔加150 μL DMSO,摇晃均匀,于570 nm波长下测定吸光度。以空白组为“1”，进行归一化处理。

2.5 制备QYYY含药血清

SPF级8～9周龄SD雄性大鼠共42只。共分为3个组,分别是空白组、QYYYH、缬沙坦组,每组14只。QYYYH:以临床剂量的5倍给予QYYY熬制的水剂灌胃;缬沙坦组:以临床剂量的5倍给予缬沙坦灌胃;空白组:以每100 g灌胃1 mL纯水。连续灌胃7 d,以人体质量为60 kg计算,药物剂量换算为人临床剂量的6.4倍。末次灌胃前1 d,完成灌胃后禁食不禁水,末次灌胃1 h后麻醉,腹主动脉取血,采血管收集,静置2 h后,3 000 r·min-1离心10 min,吸取上层血清,将同一组别的大鼠血清混合,于0.22 μm过滤器过滤后,56 ℃水浴灭活30 min,-20 ℃保存。

2.6 QYYY含药血清对大鼠足细胞的影响

实验分为6组,空白组(10%正常组大鼠血清)、模型组(10%正常组大鼠血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)、QYYYL组(2.5% QYYYH大鼠含药血清+7.5%正常大鼠血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)、QYYYM组(5% QYYYH大鼠含药血清+5%正常大鼠血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)、QYYYH组(10% QYYYH大鼠含药血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)、阳性对照组(10%缬沙坦组含药血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)。

2.7 Western blot检测

取大鼠肾脏组织,加RIPA裂解液裂解,研磨匀浆,冰上超声裂解,4 ℃ 12 000 r·min-1离心20 min,吸取上清液,BCA法测定蛋白浓度,加上样缓冲液,100 ℃煮蛋白10 min,放置-80 ℃冰箱保存。按BCA测定的上样量加样,每组20 μg,SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭1 h,4 ℃孵育一抗过夜,加入二抗(1∶4 000)室温孵育1 h,化学发光液显影,凝胶成像系统采集图像。提取经QYYY含药血清处理的大鼠足细胞总蛋白,超声裂解,其余步骤同上,显影采集图像。

2.8 免疫荧光

将细胞接种于12孔板,加药孵育24 h后,倒掉细胞上清液,用预热的PBS洗涤3遍,滴加4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗涤3遍,用PBST(0.2% triton-100PBS)配置的5%的BSA封闭液室温封闭1 h。滴加用免疫荧光一抗稀释液稀释的一抗,置于4 ℃过夜。PBS洗3遍,滴加用PBS配置的二抗,室温避光孵育1 h。PBS洗涤3遍后,滴加用水配置的DAPI,用于染细胞核,室温避光孵育10 min,PBS洗涤3遍后,抗淬灭剂封片,正置荧光显微镜选择488 nm波长拍照。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 HE染色观察QYYY对SHR肾脏的影响

HE染色发现,空白组大鼠肾脏结构紧密,肾小球形态结构清楚,肾小管排列紧密,无明显病理变化;模型组大鼠肾小球出现病理性皱缩,肾小管管腔扩张明显,细胞排列疏松紊乱,有明显的空泡;QYYYL和QYYYM大鼠肾小球萎缩,肾小管结构疏松;QYYYH大鼠肾脏肾小球无明显萎缩,肾小管排列大致正常,细胞排列较为紧密;缬沙坦组大鼠肾小球无明显萎缩,肾小管排列基本正常。见图1。

图1 各组大鼠肾脏HE染色(标尺50 μm)Fig. 1 Comparison of renal HE staining in each group (The scale of 50 μm)

3.2 Masson染色观察QYYY对SHR肾脏的影响

我们通过对Masson染色切片的观察发现,空白组大鼠无蓝色胶原沉积;模型组大鼠有明显的蓝色胶原沉积且细胞排列疏松,有明显的空泡;QYYY治疗组蓝色胶原沉积较模型组大鼠有明显的减少,其中QYYYM和QYYYH大鼠肾脏与空白组大鼠肾脏Masson切片差异不明显。见图2。

图2 各组大鼠肾脏Masson染色(标尺50 μm)Fig. 2 Comparison of renal Masson staining in each group (The scale of 50 μm)

3.3 Western blot检测SHR肾脏TRPC6、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白的表达水平

与空白组比较，模型组TRPC6、Desmin表达含量明显升高(P<0.05,P<0.001),Podocin、Nephrin的蛋白含量明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,QYYYL、QYYYM、QYYYH能明显降低TRPC6、Desmin的表达水平(P<0.05,P<0.001),并且使Podocin、Nephrin表达升高(P<0.05,P<0.01),趋于空白组的各蛋白表达水平。见图3。

注:与空白组比较,##P<0.01,###P<0.001;与模型组比较,图3 QYYY对SHR肾脏TRPC6、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白表达水平的影响Fig. 3 Effects of QYYY on protein expression levels of TRPC6, Desmin, Nephrin and Podocin in SHR kidney

3.4 MTT法测定不同浓度Ang Ⅱ对足细胞增殖的影响

通过不同浓度的Ang Ⅱ处理足细胞后,可以明显看出1×10-6、1×10-5mol·L-1的Ang Ⅱ对足细胞的增殖有明显的抑制作用(P<0.05),因1×10-6mol·L-1和1×10-5mol·L-1的Ang Ⅱ对足细胞抑制效果没有差异,所以选择1×10-6mol·L-1的Ang Ⅱ作为造模浓度。见图4。

3.5 Western blot检测足细胞TRPC6、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白的表达水平

与空白组相比,模型组足细胞TRPC6、Desmin的表达水平明显升高(P<0.05,P<0.001),Podocin、Nephrin的蛋白含量明显降低(P<0.01,P<0.001)。与模型组相比,QYYYL、QYYYM、QYYYH及缬沙坦组能明显降低TRPC6、Desmin的表达(P<0.05,P<0.01,P<0.001),并且使Podocin、Nephrin的蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。见图5。

注:与空白组比较,图4 MTT法测定不同浓度Ang Ⅱ对足细胞增殖的影响Fig. 4 The effects of different concentrations of Ang Ⅱ on podocyte proliferation by MTT assay

3.6 免疫荧光观察QYYY含药血清对足细胞TRPC6、Desmin表达水平的影响

免疫荧光观察足细胞TRPC6、Desmin的蛋白表达,TRPC6、Desmin在荧光显微镜下显示绿光,DAPI核染显示蓝光。模型组足细胞绿光与正常组相比表达强烈,细胞核膜周围荧光明显,表明在Ang Ⅱ干预的足细胞中,TRPC6、Desmin表达明显增加(P<0.001)。QYYYH绿光较模型组明显减弱(P<0.001),与QYYYL、QYYYM相比有梯度变化的趋势。QYYYH与缬沙坦组TRPC6、Desmin蛋白表达绿光更趋近于空白组。见图6。

4 讨论

肾小球是高血压早期肾损害的作用靶点之一。持续的高血压会导致肾损害,如肾小球硬化、肾小管间质纤维化[10],会破坏肾小球毛细血管内皮细胞、脏层上皮细胞的功能,从而影响肾小球基底膜的通透性,最终导致蛋白尿的形成[9]。本课题组使用HE染色和Masson染色方法,探究QYYY对于SHR肾损害病理的改善情况。HE染色发现模型组大鼠肾小球及肾小管有明显的损伤,肾小球萎缩,肾小管管壁扩张明显,QYYY干预后肾小球结构正常,肾小管细胞排列规整,其中QYYYH干预效果最为明显。Masson染色发现模型组大鼠肾小管间质出现了纤维化胶原的沉积,QYYY干预后有明显的改善,QYYYL、QYYYM肾小管及肾小球形状尚可,其中QYYYH干预效果最为明显,肾小球及肾小管形态结构趋于正常形态。实验结果提示,QYYY能明显改善肾小球萎缩及肾小管间质纤维化从而发挥肾保护作用。

足细胞作为无分裂增殖能力的终末分化细胞,其足突以规则间隔的交叉结构附着在肾小球基底膜上,相邻的足突所形成的一系列过滤缝隙成为裂孔隔膜(Slit diaphragms,SDs),参与维持肾小球滤过屏障的稳定[11-13]。SDs通常由紧密连接和黏附连接的蛋白质组成,例如Nephrin、Neph1和Podocin、紧密连接蛋白(ZO-1)和TRPC6等[14-15]。TRPC6是非选择性的阳离子通道蛋白TRP家族的成员之一,Na+、K+、Ca2+都经其通过,但其对Ca2+通透性最大,上调的TRPC6的表达使足细胞内Ca2+水平升高,不仅可以诱导足细胞凋亡[16],减少足细胞数量,导致骨架蛋白排列紊乱,还可以促进足突的消失及融合造成足细胞损伤[17]。相关文献及前期研究均证实,高血压状态下,肾脏内Ang Ⅱ的浓度显著升高,且远高于循环血水平[18-19]。Ang Ⅱ作为RAS中主要效应分子,可诱导肾小球足细胞损伤,TRPC6表达水平升高[20]。Nephrin特异定位于足细胞足突SDs处,是构成足细胞SDs的关键蛋白[21]。Nephrin具有细胞信号转导和黏附分子的功能,在保持足细胞完整性方面起着重要作用,当Nephrin表达减少或分布异常时,会导致足细胞SDs结构发生改变,最终导致足细胞和肾小球损伤,它是判断肾小球足细胞急性损伤的一个早期重要指标[22-23]。

注:与空白组比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;与模型组比较,图5 QYYY含药血清对足细胞TRPC6、Desmin、Nephrin、podocin蛋白表达水平的影响Fig. 5 Effects of QYYY containing serum on protein expression levels of TRPC6, Desmin, Nephrin and Podocin in podocytes

注:与空白组比较,###P<0.001;与模型组比较,**P<0.01,***P<0.01。图6 免疫荧光观察QYYY含药血清对足细胞TRPC6、Desmin蛋白表达水平的影响(标尺50 μm)Fig. 6 Effects of QYYY containing serum on the expression levels of TRPC6 and Desmin proteins in podocytes were observed by immunofluorescence (The scale of 50 um)

Podocin是由基因NPSH2编码的SDs蛋白,它和Nephrin同样定位于SDs区域,Podocin和Nephrin在体外有直接的相互协同作用,Podocin在足突形成过程中吸附和稳定Nephrin[21]。Podocin、Nephrin及其他相关蛋白之间相互作用形成蛋白复合体,在介导足细胞SDs与足突细胞骨架连接方面起重要作用[24],任一编码足细胞标志物的基因缺失或突变,足细胞结构及肾小球正常滤过功能均会受到影响[25]。TRPC6与Nephrin、Podocin等其他足细胞标记蛋白形成复合结构,可与足细胞其他骨架蛋白相互作用共同参与足细胞间的信号传导、细胞极化和稳定骨架结构等生理功能[26-27]。

本研究结果显示,在动物实验中发现模型组大鼠肾脏皮质组织中TRPC6较空白组蛋白表达明显升高,Nephrin和Podocin较空白组表达明显下降,而QYYYL、QYYYM、QYYYH组TRPC6较模型组表达下降,而Nephrin和Podocin表达明显升高,并且随着QYYY剂量的升高,该现象越显著。体外实验中,Ang Ⅱ可使足细胞TRPC6蛋白表达升高,Nephrin和Podocin蛋白表达下降,提示Ang Ⅱ导致大鼠足细胞损伤,而QYYYL、QYYYM、QYYYH能明显下调TRPC6的表达以及上调Nephrin和Podocin的表达水平,提示QYYY可能通过上调TRPC6、下调Nephrin和Podocin的表达水平，从而改善Ang Ⅱ诱导的足细胞损伤。

足细胞骨架蛋白的表达、分布以及排列方式均与细胞的功能密切相关,Desmin作为足细胞骨架的中间丝蛋白,正常情况下处于不表达或低表达水平,当足细胞受损时,骨架蛋白重新排列,Desmin会大量表达[28]。有研究发现Desmin的表达与足细胞损伤呈显著正相关,Desmin可以作为足细胞损伤的标志物[29]。

本研究结果显示,在对以SHR为研究模型,QYYY为干预手段的动物实验中,本课题组发现模型组大鼠肾脏皮质组织中Desmin表达含量显著升高,说明肾脏足细胞发生了明显的损伤。QYYYL、QYYYM、QYYYH中Desmin表达较模型组降低。这说明QYYY能改善SHR的肾脏足细胞损伤。相关研究发现,Ang Ⅱ可直接作用于足细胞,诱导其凋亡,破坏足细胞滤过屏障的完整性[30-31]。本研究体外实验发现,Ang Ⅱ可使足细胞Desmin表达升高,造成足细胞损伤,QYYYL、QYYYM、QYYYH能明显下调Desmin的表达水平,从而改善足细胞损伤。

方祝元教授创新性地提出高血压“病初即可及肾”,并认为高血压早期肾损害是“因实致病”的创新理论,并依据清肝补肾、化瘀通络法创制了QYYY(鬼针草、制何首乌、酒山萸肉、玄参、川牛膝、泽泻),主要治疗高血压肾损害的肝阳亢盛、肝肾阴虚、瘀阻肾络证型。该组方着力以平肝潜阳为功,兼能清肝补肾、化瘀通络。鬼针草、制首乌清肝泻热、化瘀通络、滋补肝肾是为君药,酒萸肉、玄参补益肝肾、收涩精气是为臣药,泽泻、川牛膝利水泻热、化瘀利尿是为佐使。基于此方意,以中医理论“肝阳亢盛、肝肾阴虚、瘀阻肾络”是高血压肾损害中心环节作为切入点,在分子生物学水平可能表现为改善Ang Ⅱ造成的足细胞损伤,从而发挥肾保护作用。

综上所述,SHR肾脏有明显的病理变化,并且在肾脏皮质组织中,TRPC6及Desmin表达升高,Nephrin、Podocin表达下降。QYYY能明显改善SHR肾脏肾小球萎缩及肾小管间质纤维化从而发挥肾保护作用,并且能下调TRPC6和Desmin的表达,上调Nephrin和Podocin的表达,改善足细胞损伤。体外实验则证实了QYYY含药血清能调节因Ang Ⅱ导致的足细胞标志物蛋白异常的表达,然而具体机制以及该方中调控足细胞损伤有效成分还有待进一步研究。