高效液相色谱串联傅里叶变换离子回旋共振质谱法鉴定二丁颗粒的化学成分

石松安,张瓒,韩静,韩飞

(沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳 110016)

二丁颗粒是由紫花地丁、半边莲、蒲公英、板蓝根4味药材组成的中药成方制剂,是清火解毒的常用药,多用于火热毒盛所致的热疖痈毒、咽喉肿痛、风热火眼等[1]。除了常用的清热解毒功能外,二丁颗粒还有抑菌抗炎的作用,在临床上被用于治疗急性咽炎和慢性支气管炎[2-4]。研究表明,秦皮甲素、秦皮乙素是君药紫花地丁主要活性成分,具有抗炎、抗肿瘤作用[5-7],且秦皮乙素作为二丁颗粒的质量控制指标收录于2020年版《中国药典》中[1]。表告依春是板蓝根中抗病毒的主要活性成分之一[8-9]。此外,蒲公英中含有的单咖啡酰酒石酸、菊苣酸、咖啡酸和阿魏酸等有效成分具有抑菌、抗炎、抗氧化、保肝利胆等药理作用,临床用于治疗疔疮肿毒、乳痈、瘰疬、目赤、咽痛、湿热黄疸等疾病[10-12]。为了全面阐明二丁颗粒的药效物质基础,有必要开展其化学成分的鉴定研究。

高效液相色谱串联傅里叶变换离子回旋共振质谱(HPLC-FT-ICR-MS)具有极高的分辨率、准确度和灵敏度,可以提供最可靠的元素组成和分子式,是测定小分子精确分子量及结构解析的首选方法[13]。本研究采用HPLC-FT-ICR-MS技术对二丁颗粒所含的化学成分进行了分析,为进一步阐释其药效物质基础提供了依据。

1 材料

1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司),AG285型十万分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司),FA2004型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司),KQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),Solarix 7.0T FT-ICR MS质谱仪(德国Bruker公司),Data Analysis软件(德国Bruker公司)。

L-精氨酸(纯度≥98.0%，批号:MKBD3032V)、鸟苷(纯度≥98.0%，批号:AJ0609NA14)、L-苯丙氨酸(纯度≥98.0%，批号:H02J11H117318)、秦皮乙素(纯度≥98.0%，批号:C25J7Y18390)、地奥司明(纯度≥95.0%，批号:Y18S6H1)、汉黄芩苷(纯度≥98.0%，批号:R27M10F89336)、L-苹果酸(纯度≥98.0%，批号:S08J12I136815)、原儿茶酸(纯度≥98.0%，批号:Z30M6L1)、无水柠檬酸(纯度≥98.0%，批号:SM0425GA14)、秦皮甲素(纯度≥98.0%，批号:KA0422CA14)、芦丁(纯度≥98.0%，批号:T20N11Z131674)、类叶升麻苷(纯度≥98.0%，批号:W14O10C100217)、金丝桃苷(纯度≥98.0%，批号:P12S11F124379)、芹菜素(纯度≥98.0%，批号:T30A11F112008)购自上海源叶生物科技有限公司;蒙花苷(纯度：98.0%，批号:AF9081822)、荭草苷(纯度：98.0%，批号:AF20091007)、单咖啡酰酒石酸(纯度：98.0%，批号:AF20121103)、党参炔苷(纯度：98.0%，批号:AF20051902)购自成都埃法生物科技有限公司;木犀草苷(纯度：99.8%，批号:MUST-15012204)、菊苣酸(纯度：99.4%，批号:MUST-15011614)购自成都曼斯特生物科技有限公司;木犀草素(供含量测定用,批号:111520-200201)购自中国药品生物制品检定所;腺苷(纯度≥98.0%，批号:FY20141101)购自南通飞宇生物科技有限公司。乙腈、甲醇(色谱纯,美国Fisher公司)，甲酸(色谱纯,成都市科隆化学品有限公司)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

本研究所用的二丁颗粒由修正药业集团长春高新制药有限公司提供,批号:200423D,每袋20 g。

2 方法与结果

2.1 样品的制备与前处理

2.1.1 对照品溶液的制备 分别取L-精氨酸、鸟苷、L-苯丙氨酸、秦皮乙素、地奥司明、汉黄芩苷、L-苹果酸、原儿茶酸、无水柠檬酸、秦皮甲素、芦丁、类叶升麻苷、金丝桃苷、芹菜素、蒙花苷、荭草苷、单咖啡酰酒石酸、党参炔苷、木犀草苷、菊苣酸、木犀草素、腺苷对照品适量,精密称定,置于5 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻线,摇匀,制成各对照品贮备液。精密移取各储备液适量至同一量瓶中,甲醇溶解并定容至刻线,摇匀,制成混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取二丁颗粒2.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中,加入60%乙醇10 mL,称质量,超声震荡30 min,放冷至室温,再次称质量,用60%乙醇补足减失的质量,摇匀,12 000 r·min-1离心4 min,上清液采用0.22 μm微孔有机滤膜过滤,即得供试品溶液。

2.2 实验条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Kinetex 2.6 μm C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,2.6 μm),流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱:0～5 min,5%～10%A;5～10 min,10%A;10～11 min,10%～17%A;11～23 min,17%A;23～33 min,17%～42%A;33～43 min,42%A;43～50 min,42%～55%A;50～55 min,55%A。流速1.0 mL·min-1,柱温30 ℃,进样量10 μL。

2.2.2 质谱条件 电喷雾电离(ESI)源;正、负离子扫描模式;质量范围:m/z100～1 500;毛细管电压:正离子模式(-4.5 kV)/负离子模式(4.5 kV);雾化气(N2)压力:2.0 bar;干燥气(N2)流速:6 L·min-1;传输毛细管温度:220 ℃;扫描次数:1次;离子飞行时间:0.8 ms;终板补偿电压:-500 V(正离子模式)/500 V(负离子模式);初始碰撞能:20 V,随离子动态调整;数据采集系统:FTMS Control 2.1,数据处理系统:Data Analysis 4.4。

2.3 HPLC-FT-ICR-MS法鉴定二丁颗粒的化学成分

取二丁颗粒样品,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下的色谱和质谱条件进样分析,二丁颗粒供试品溶液和对照品溶液分别在正、负离子2种模式下进样分析,其基峰离子流色谱图如图1～2所示。通过高分辨质谱信号解析、与对照品及文献数据比对[14-18],在二丁颗粒中共表征了106个化学成分,其中包含33个黄酮类、27个生物碱类、23个有机酸类、7个香豆素类、4个木质素类、3个倍半萜类、1个炔类以及8个其它类型化合物，详细数据见表1。通过与对照品的保留时间、精确分子量和二级质谱信息比较,准确鉴定了22个化合物,其中黄酮类化合物9个,分别是荭草苷(46号峰)、芦丁(67号峰)、金丝桃苷(70号峰)、木犀草苷(72号峰)、地奥司明(87号峰)、蒙花苷(93号峰)、木犀草素(95号峰)、汉黄芩苷(96号峰)、芹菜素(100号峰)。生物碱类化合物4个,分别是L-精氨酸(1号峰)、腺苷(5号峰)、鸟苷(6号峰)和L-苯丙氨酸(7号峰)。有机酸类化合物6个,分别是L-苹果酸(3号峰)、柠檬酸(4号峰)、原儿茶酸(8号峰)、单咖啡酰酒石酸(11号峰)、类叶升麻苷(74号峰)、菊苣酸(99号峰)。香豆素类化合物2个,分别是秦皮甲素(14号峰)和秦皮乙素(28号峰)。炔类化合物1个,为党参炔苷(88号峰)。

注：A.供试品;B.混合标准品图1 二丁颗粒供试品和混合标准溶液在正离子模式下的基峰离子流色谱图Fig. 1 Base peak ion flow chromatograms of Erding Granules and mixed standard solution in positive ion mode

注：A.供试品;B.混合标准品图2 二丁颗粒供试品和混合标准溶液在负离子模式下的基峰离子流色谱图Fig. 2 Base peak ion flow chromatograms of Erding Granules and mixed standard solution in negative ion mode

表1 HPLC-FT-ICR-MS鉴定的二丁颗粒中化学成分

(续表一)

(续表二)

(续表三)

2.3.1 黄酮类化合物的质谱解析 化合物72保留时间为18.35 min,在正、负离子一级全扫描模式下分别检测到其准分子离子峰[M+H]+m/z449.107 81(误差0.07×10-6)和[M-H]-m/z447.093 39(误差-0.23×10-6),通过DataAnalysis软件预测其分子式为C21H20O11。在负离子模式下对其进行碰撞裂解,得到相关的二级碎片离子m/z327.051 31 [M-H-C4H8O4]-和m/z285.040 68 [M-H-C6H10O5]-。裂解方式与文献报道一致[19],经对照品比对后,确认该化合物为木犀草苷,其裂解方式如图3所示。

图3 木犀草苷的碎片离子谱图(A)和裂解方式(B)Fig. 3 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of luteolin

2.3.2 有机酸类化合物的质谱解析 化合物4保留时间为1.66 min,在负离子一级全扫描模式下检测到其准分子离子峰 [M-H]-m/z191.019 99(误差-1.37×10-6),通过DataAnalysis软件预测其分子式为C6H8O7。在负离子模式下对其进行碰撞裂解,得到相关的二级碎片离子m/z173.009 20 [M-H-H2O]-、m/z129.019 35 [M-H-CO2]-和m/z111.008 79 [M-H-H2O]-。裂解方式与文献报道一致[20],经对照品比对后,确认该化合物为柠檬酸,其裂解方式如图4所示。

图4 柠檬酸的碎片离子谱图(A)和裂解方式(B)Fig. 4 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of citric acid

2.3.3 香豆素类化合物的质谱解析 化合物28保留时间为9.61 min,在正、负离子一级全扫描模式下分别检测到其准分子离子峰[M+H]+m/z179.033 90(误差-0.08×10-6)和[M-H]-m/z177.019 49(误差-0.86×10-6),通过DataAnalysis软件预测其分子式为C9H6O4。在负离子模式下对其进行碰撞裂解,得到相关的二级碎片离子m/z133.029 36 [M-H-CO2]-。裂解方式与文献报道一致[18],经对照品比对后,确认该化合物为秦皮乙素,其裂解方式如图5所示。

图5 秦皮乙素的碎片离子谱图(A)和裂解方式(B)Fig. 5 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of Esculetin

2.3.4 生物碱类化合物的质谱解析 化合物6保留时间为2.26 min,在正、负离子一级全扫描模式下分别检测到其准分子离子峰[M+H]+m/z284.099 27(误差-1.13×10-6)和[M-H]-m/z282.084 93(误差-1.90×10-6),通过DataAnalysis软件预测其分子式为C10H13N5O5。在正离子模式下对其进行碰撞裂解,得到相关的二级碎片离子m/z152.056 09 [M+H-C5H8O4]+。裂解方式与文献报道一致[21],经对照品比对后,确认该化合物为鸟苷,其裂解方式如图6所示。

图6 鸟苷的碎片离子谱图(A)和裂解方式(B)Fig. 6 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of guanosine

3 讨论

3.1 色谱条件选择

本实验考察了不同流动相洗脱行为,分别为甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%甲酸水溶液,发现乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相洗脱时各成分色谱峰分离度较好,出峰时间适中;考察了柱温25、30、35 ℃,发现30 ℃时分离度、峰形较好。综上所述,最优色谱条件为Kinetex C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,2.6 μm);流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B);柱温：30 ℃;进样量：10 μL。

3.2 提取条件选择

本实验考察了不同提取溶剂对二丁颗粒的提取效率的影响。提取溶剂分别为甲醇[22]、70%甲醇[23]、水、乙醇、60%乙醇[5],发现以60%乙醇为提取溶剂时各成分综合提取率最高;考察了超声提取和回流提取2种提取方式,发现超声提取效率优于回流提取;还考察了不同提取时间(15、30、45 min)和提取溶剂体积(10、20、30 mL),发现提取溶剂体积为10 mL,提取时间为30 min时各成分基本提取完全。综上所述,最优提取条件为10 mL 60%乙醇超声提取30 min。

本研究采用HPLC-FT-ICR-MS指认出二丁颗粒中106个化合物,准确鉴定了其中22个化合物,推测了84个化合物的结构,初步阐释了二丁颗粒的化学物质组成,为其进一步的药效物质基础研究提供了依据。