芳香新塔花总黄酮的HPLC 指纹图谱研究及化学模式识别分析

张建新，燕雪花，马 昕，王东东，刘宏炳

(1. 新疆医科大学 中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2. 新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011)

芳香新塔花Ziziphora clinopodioidesLam.为唇形科新塔花属多年生半灌木草本植物[1]，别名唇香草、小叶薄荷、山薄荷等。主要分布在我国新疆维吾尔自治区，亚洲的哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、蒙古等国也有分布。广泛用于风热感冒、高血压及动脉粥样硬化等相关疾病的治疗。现代研究表明芳香新塔花化学成分主要包括黄酮类、多酚类、挥发油类、氨基酸类、有机酸类等[2-5]，具有抗氧化、抗炎杀菌、舒张血管、降血压等药理作用[6]。相关研究表明芳香新塔花总黄酮具有抑制炎症反应、保护过氧化氢损伤的人脐静脉内皮细胞等作用[7-8]，并具有抗氧化及对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[9-10]。由此可见芳香新塔花总黄酮是芳香新塔花发挥药理作用的重要物质基础，然而，现有药材标准中只有关于芳香新塔花性状及鉴别等相关信息，无法反映其总黄酮质量，且现有关于芳香新塔花的指纹图谱研究[11-12]主要是其挥发性成分的研究，缺少其总黄酮的质量控制研究。因此，本研究以木犀草苷、芦丁、芹菜苷和蒙花苷为指标，通过HPLC 方法建立芳香新塔花总黄酮的化学指纹图谱，并结合化学模式识别分析对15 批芳香新塔花样品进行分析，为该药材总黄酮提取物的质量控制和鉴定研究提供科学依据。

1 仪器与试剂

1.1 药材

芳香新塔花药材产地为新疆，购自安徽济善堂中药科技有限公司，所有样品经新疆医科大学中医学院中药资源教研室徐海燕副教授鉴定均为唇形科新塔花属芳香新塔花药材正品，15 批样品（S1-S15）批号分别为150801、160501、170302、180601、180902、181103、190101、190302、190501、190702、190901、191001、200101、200201、200301，批号6 位数字每2 位分别代表不同采收年份、月份和日期。

1.2 仪器

Agilent 1220 LC 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；ME204E 型分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；KQ-5200DE 型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；RT-08 型多功能粉碎机（荣聪精密科技有限公司）。

1.3 试剂

木犀草苷（批号：5373-11-5，含量大于98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；芹菜苷（批号：Q-077-150720，含量大于98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；芦丁（批号：100080-201810，含量大于98%，中国食品药品检定研究院）；蒙花苷（批号：111528-201809，含量大于98%，中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，美国Fisher 公司）；磷酸（分析纯，批号：20180209，天津市致远化学试剂有限公司）；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil ODS-2 C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm），流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0 ～ 28 min，25% ～ 28%A；28 ～ 40 min，28% ～ 30%A；40 ～ 65 min，30% ～ 39%A；流速：1 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：26 ℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称量木犀草苷、芦丁、芹菜苷、蒙花苷对照品并分别制成1.0 mg/mL 的对照品甲醇溶液。分别取上述木犀草苷、芦丁、芹菜苷、蒙花苷对照品溶液70 μL、15 μL、500 μL、30 μL，加入甲醇混匀定容至1 mL，混合标准品溶液中各对照品浓度分别为70 μL/mL、15 μL/mL、500 μL/mL 和30 μg/mL。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取芳香新塔花粉末，加入50%乙醇水溶液，料液比为0.025 g/mL，185 ℃加热回流提取2 h，过滤，将滤液浓缩后干燥。提取物经过X-5 大孔吸附树脂分离纯化后浓缩干燥即得芳香新塔花总黄酮粉末，总黄酮含量为76%。精密称取芳香新塔花总黄酮粉末1.0 mg 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜滤过即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度 取上述混合对照品溶液，重复进样6 次，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，以蒙花苷作为参比峰，计算相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别在0.115 9% ～ 0.158 5%和1.161 4% ～ 1.701 9%范围内，均小于2.0%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性 按照“2.3”项下方法制备S1 批次样品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h 进样，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，选择蒙花苷作为参比峰，计算4 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 值分别在0.069 7% ～ 0.159 6%和0.389 3% ～1.295 6%范围内，均小于2.0%，表明芳香新塔花总黄酮溶液在24 h 内稳定。

2.4.3 重复性 按照“2.3”项下方法制备6 份S1 批次样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，选择蒙花苷作为参比峰，计算4 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 值分别在0.513 9% ～ 0.567 4%和1.416 1% ～ 2.307 8%范围内，均小于2.5%，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱测定要求。

2.5 芳香新塔花总黄酮HPLC 指纹图谱的建立、相似度评价及共有峰相关分析

2.5.1 样品测定及指纹图谱的建立 按照“2.3”项下方法制备15 批芳香新塔花总黄酮的样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，得到15 批芳香新塔花总黄酮的HPLC 色谱图，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A 版）”软件，以S10 为参照图谱，时间窗宽度为0.5，采用平均数法生成对照图谱。通过多点校正和Mark 峰匹配建立指纹图谱叠加图并生成对照指纹图谱（R），见图1。15 批样品共标记14 个共有峰，对其中4 个共有峰（木犀草苷-5 号峰、芦丁-7 号峰、芹菜苷-9 号峰、蒙花苷-14 号峰）进行了指认，见图2。

图1 15 批样品HPLC 指纹图谱及其对照图谱（R）Fig. 1 HPLC fingerprints of 15 batches of samples and common mode of HPLC fingerprints （R）

图2 混合对照品HPLC 色谱图（A）及样品对照指纹图谱（B）Fig. 2 HPLC of mixed reference substances （A） and common mode of HPLC fingerprints of sample （B）

2.5.2 相对峰面积和相对保留时间的计算 以14号峰-蒙花苷作为参照色谱峰（S），计算14 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算其RSD 值，见表1、表2。结果表明各共有峰的相对保留时间的RSD ＜ 7.309%，出峰时间稳定；相对峰面积的RSD ＜87.932%，说明在不同时期采收的芳香新塔花中提取的芳香新塔花总黄酮样品之间存在差异。

表1 15 批样品共有峰相对保留时间Tab. 1 Relative retention time of common peaks of 15 batches of samples

表2 15 批样品共有峰相对峰面积Tab. 2 Relative peak area of common peaks of 15 batches of samples

2.5.3 相似度评价 将样品S1-S15 的HPLC 色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版A）”软件，计算各批次样品之间与R的相似度，结果见表3。结果表明15 批芳香新塔花总黄酮样品与R的相似度在0.921 ～ 1.000 之间，表明15 批芳香新塔花总黄酮样品质量较稳定。

表3 15 批样品HPLC 指纹图谱相似度结果Tab. 3 HPLC fingerprint similarity results of 15 batches of samples

2.6 化学模式识别分析

2.6.1 聚类分析（Cluster analysis, CA） 利用SPSS 25.0 软件对15 批样品进行系统聚类分析，结果见图3。分类距离=10，S1-S15 被分为2 类：S1-S3为一类，S4-S15 为一类；分类距离= 25，S1-S15 被分为1 类。结果表明15 批样品中2015 至2017 年生

图3 15 批样品聚类分析树状图Fig. 3 Dendrogram of cluster analysis of 15 batches of samples

产的芳香新塔花总黄酮提取物与2018 至2020 年生产的芳香新塔花总黄酮提取物之间差异较大，一方面可能因为各成分含量随时间变化有所变化；另一方面可能与气候变化等因素有关。而年份相近的样品之间差异较小，表明15 批芳香新塔花总黄酮样品在一定时间内质量较稳定。

2.6.2 主成分分析（Principal component analysis,PCA） 主成分分析是一种用于特征提取和降维的化学计量学方法，广泛用于将大量原始变量简化为适当数量的主成分[13-14]。为了进一步研究15 批样品间的质量差异，利用SPSS 25.0 软件对样品进行PCA分析。以特征值大于1 为标准，得到前4 个主成分的累积方差贡献率为85.609% ＞ 80%，表明4 个主成分可以反映样品80%以上的质量信息，见表4、图4。

图4 主成分分析碎石图Fig. 4 Scree plot of PCA

表4 主成分特征值和方差贡献率Tab. 4 The principal component value and variance contribution rate

将15 批样品各共有峰峰面积利用SPSS 25.0 软件进行标准化处理，标准化数据用ZV表示，以最大方差法对变量进行正交旋转[15-16]，得到旋转后的公共因子载荷矩阵并绘制15 批样品的主成分载荷图，见表5、图5。结果表明14 个共有峰均对主成分1 呈正相关；共有峰ZV1-ZV4、ZV8、ZV9、ZV11、ZV12对主成分2 呈正相关；共有峰ZV6、ZV8-ZV14对主成分3 呈正相关；共有峰ZV3、ZV4、ZV7-ZV10、ZV13对主成分4 呈正相关。

表5 旋转后的公共因子载荷矩阵Tab. 5 Common factor loading matrix after rotation

图5 15 批样品的主成分载荷图Fig. 5 Loading plot of 15 batches of samples

以F1、F2、F3、F4分别代表上述提取的4 个主成分，根据表5 结果，各主成分得分为：

F1= 0.273ZV1+ 0.277ZV2+ 0.277ZV3+ 0.290ZV4+0.323ZV5+ 0.262ZV6+ 0.309ZV7+ 0.097ZV8+ 0.208ZV9+0.312ZV10+ 0.271ZV11+ 0.332ZV12+ 0.252ZV13+0.149ZV14；

F2= 0.358ZV1+ 0.044ZV2+ 0.097ZV3+ 0.112ZV4-0.127ZV5- 0.404ZV6- 0.271ZV7+ 0.500ZV8+ 0.337ZV9-0.023ZV10+ 0.127ZV11+ 0.078ZV12- 0.192ZV13-0.415ZV14；

F3= -0.015ZV1- 0.480ZV2- 0.083ZV3- 0.329ZV4-0.164ZV5+ 0.190ZV6- 0.249ZV7+ 0.264ZV8+ 0.393ZV9+0.111ZV10+ 0.155ZV11+ 0.113ZV12+ 0.171ZV13+0.476ZV14；

F4= -0.089ZV1- 0.227ZV2+ 0.309ZV3+ 0.332ZV4-0.189ZV5- 0.050ZV6+0.066ZV7+ 0.020ZV8+ 0.224ZV9+0.143ZV10- 0.542ZV11- 0.276ZV12+ 0.486ZV13- 0.121ZV14。

根据表4 结果，以各主成分的方差贡献率为权数，对主成分得分值进行加权计算综合得分F=（48.142F1+ 19.964F2+ 9.723F3+ 7.780F4）/85.609，根据综合得分对15 批样品排序，得分越高样品质量越好，结果见表6。

表6 15 批样品主成分得分、综合得分及排序Tab. 6 Principal component score, comprehensive score and ranking of 15 batches of samples

2.6.3 偏最小二乘法- 判别分析（Discriminant analysis of partial least squares, PLS-DA） 为了进一步分析样品间存在差异的原因，将15 批芳香新塔花总黄酮样品中的14 个共有峰峰面积数据导入Simca-P 14.1 软件。建立有监督模式的PLS-DA 模型[17]。提取得到3 个主成分，R2Y 为0.927，Q2为0.622，均高于0.5，证明模型具有较好的稳定性和预测力[18]。设置分类Y 矩阵变量随机排列20 次做置换检验，得置换检验图，见图6。R2拟合直线在Y 轴的截距为0.19 ＜ 0.3，Q2拟合直线在Y 轴的截距为-0.353 ＜ 0.05，说明所构建的模型不存在过度拟合现象[19-20]。经PLS-DA 模型分析分别生成得分图、载荷图和变量重要性投影值图（VIP 图），分别见图7-图9。得分图表明所有数据均在95%置信区间内，样品S1-S3 分为一类，S6-S9、S13 分为一类，其余样品分为一类，该结果与聚类分析结果相同。由图8、9 可知共有峰14 号-蒙花苷、6号、4 号、2 号、7 号-芦丁距离原点较远且VIP ＞1，是引起不同批次芳香新塔花总黄酮差异的主要标志性成分。

图6 PLS-DA 置换检验图Fig. 6 PLS-DA permutation test

图7 PLS-DA 得分散点图Fig. 7 PLS-DA score plot

图8 PLS-DA 载荷散点图Fig. 8 PLS-DA loading plot

图9 PLS-DA VIP 值图Fig. 9 VIP plot of PLS-DA

3 讨论

课题组前期通过HPLC 法同时测定芳香新塔花总黄酮中木犀草苷、芦丁、芹菜苷的含量[21]，对不同流速、不同色谱柱、不同洗脱梯度等色谱条件进行了考察，最终确定“2.1”项下色谱条件。

本研究在15 批样品所有共有峰中选择峰面积百分比大于 2.5%的14 个共有峰进行峰匹配和相似度分析，15 批样品的14 个共有峰面积百分比在69.14% ～80.13%之间，具有代表性。在PLS-DA 分析过程中，考察了提取不同数量主成分对PLS-DA模型的影响，当提取2 个主成分时，模型解释率和预测值偏低，提取4 个主成分时，模型解释率和预测值较高，但置换检验图中R2拟合直线在Y 轴的截距大于0.3，存在过度拟合情况，因此该PLS-DA 模型提取3 个主成分进行分析。

通过CA 分析将15 批样品明显分为两类，通过PCA 分析对样品质量进行排序结果可见2018 年之后生产的芳香新塔花中总黄酮提取物总体质量明显优于2018 年之前，说明随时间变化，芳香新塔花总黄酮样品含量有所降低，也可能与气候等变化因素有关。PLS–DA 分析模型提取了三个主成分，因此2018 年之后生产的10 批样品又被进一步分为三类，即第一类：S1 – S3；第二类：S6 – S9、S13；第三类：S4、S5、S10 – S12、S14 和S15，结果表明不同采收月份与样品分类和质量排序之间无明显相关性规律，因此表明该厂家生产的不同批次芳香新塔花中提取的芳香新塔花总黄酮质量无明显差异。由于该实验没有指认出2 号、4 号和6 号峰，因此后续需要进一步指认以上成分且对不同批次样品成分进行含量测定，才能进一步确定VIP ＞ 1 的各成分对芳香新塔花总黄酮质量影响的规律。

4 结论

本研究建立的芳香新塔花总黄酮的HPLC 指纹图谱确定了14 个共有峰并指认了4 个成分（木犀草苷、芦丁、芹菜苷、蒙花苷），通过PCA 分析对15批样品质量排序为S9 ＞S15 ＞S4 ＞S5 ＞S14 ＞S10 ＞S11 ＞S12 ＞S2 ＞S13 ＞S3 ＞S6 ＞S8 ＞S1 ＞S7。该方法稳定性、重复性、精密度良好且操作简单易行，可为芳香新塔花总黄酮的质量控制提供参考，也为后期芳香新塔花总黄酮有效部位的制剂开发等研究提供了参考。本研究建立的芳香新塔花总黄酮质量控制方法补充和丰富了芳香新塔花的质量评价标准，具有一定的理论和实际意义。