基于网络药理学和分子对接技术探讨葶苈大枣泻肺汤治疗慢性肺心病的作用机制

李 倩，申凤霞，马 云，聂宗恒，范建伟，关永霞，张贵民

(1.鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276005；2. 鲁南制药集团股份有限公司 中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；3. 鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006）

慢性肺源性心脏病（Chronic pulmonary heart disease）是一类由慢性阻塞性肺病等疾病引起的肺组织结构和功能异常，继发心脏功能障碍的临床综合征，又名肺心病[1]，其临床主要表现为咳嗽、气促、喘息等呼吸系统障碍，急性加重期则表现为呼吸衰竭、右心衰竭等[2]。肺心病的中老年发病率高，晚期存活率低，随着环境严重污染以及老年化进程加快，该病患病率急剧上升。目前临床治疗肺心病主要针对患者肺部基础疾病进行对症治疗，但只能减轻症状，无法改变疾病进程[3]。

肺心病按中医理论属本虚标实之症，归属于“肺胀”“痰饮”“水肿”等中医范畴，本虚以肺、脾、肾气虚为主，标实以痰盛、水泛、血瘀为主，因此，辨证施治首推泻肺除壅中药[4]。葶苈大枣泻肺汤首载于《金匮》卷上，又名“葶苈大枣汤”“葶苈泻肺汤”，由葶苈子、大枣两味药组成，药用历史悠久，具有泻肺行水、下气平喘之功用[5]。现代药理学研究表明，葶苈大枣泻肺汤具有缓解心衰症状、改善患者血流动力学等作用[6-7]，临床上主要用于支气管肺炎、心力衰竭等疾病的治疗[8-9]。目前葶苈大枣泻肺汤治疗肺心病的研究缺乏足够的循证医学依据，且其作用机制尚不明确。因此，本研究基于分子对接结合网络药理学的策略，分析葶苈大枣泻肺汤的主要活性成分和潜在靶标，以期阐释其可能的药效物质基础和分子作用机制，为临床实践提供较可靠的证据。

1 材料与方法

1.1 葶苈大枣泻肺汤药效成分的收集

通过TCMSP 数据库[10]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）检索葶苈子和大枣，以药物口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为条件进行筛选，搜集葶苈大枣泻肺汤的潜在药效成分。

1.2 药效成分对应靶点库和肺心病相关靶点库的构建

首先通过ChemBioDraw 软件查询潜在药效成分的SMILES 字符串，并将其输入SwissTarget Prediction 数据库[11]中进行靶点预测，将所得靶点矫正统一后即得活性成分相关靶点信息。随后以“Chronic pulmonary heart disease”为关键词在Gene Cards 数据库中进行检索，获得慢性肺心病的相关靶点蛋白。最终将葶苈大枣泻肺汤与慢性肺心病的靶点同时录入“Venny 2.1 在线作图工具平台”上，绘制韦恩图，取两者的交集，得到葶苈大枣泻肺汤治疗肺心病的预测靶点。

1.3 蛋白互作网络和“药物-化合物-靶点”网络图的构建

将上述所得的共同靶点导入STRING 11.0 数据库，获取蛋白互作网络（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），并保存成TSV 格式的文件。将文件导入到Cytoscape V 3.6.1 软件中，获取葶苈大枣泻肺汤治疗慢性肺心病靶蛋白的相互作用网络，随后利用“Network Analyer”功能对PPI 网络进行拓扑学分析，以Degree 值为参考。将葶苈大枣泻肺汤药效成分和共同靶点同样导入Cytoscape V 3.6.1 软件，构建“药物-化学成分-靶点”相互作用网络图。

1.4 GO（Gene Ontology）生物分析与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析

将上述潜在作用靶点输入到DAVID 6.8 数据库中，获得GO 生物功能富集和KEGG 通路分析，限定P＜ 0.05。GO 生物分析通过生物途径（Biology process，BP）、分子功能（Molecular function, MF）、细胞组分（Cellular component，CC）三个方面进行说明与注释。

1.5 关键蛋白和活性成分的分子对接验证

在上述步骤基础上，分别选取6 个关键靶点蛋白作为受体，葶苈大枣泻肺汤中5 个关键药效成分作为配体，进行分子对接验证。首先在PDB 数据库下载蛋白的三维结构，利用Pymol 和Autodocktools 软件对蛋白进行去水分子处理以及加氢加电荷等处理；在PubChem 数据库中下载活性分子的三维结构，利用Autodock Vina 软件进行分子对接验证，对接参数设置为默认，根据分子与靶点的最低结合能进行分析验证。

2 结果

2.1 葶苈大枣泻肺汤药效成分的筛选

通过TCMSP 数据库检索得到葶苈子的药效成分11 个、大枣的药效成分17 个，有2 个重复化学成分，去重后最终得到26 个药效成分。根据OB 值大小进行排列，具体信息见表1。

表1 葶苈大枣泻肺汤中活性成分Tab. 1 Active ingredients of Tingli Dazao Xeifei decoction

2.2 药效成分靶点与慢性肺心病靶点的检索结果

通过Swiss Target Prediction 数据库对葶苈大枣泻肺汤中的26 个潜在活性成分进行靶点预测，将预测靶标综合筛选，保留唯一值，获得771 个预测药物靶点。利用GeneCards 数据库查询慢性肺心病的靶点，检索得到1 576 个相关靶点，根据相关性进行排名，取前300 的靶点进行下一步分析。运用Venny 平台将葶苈大枣泻肺汤的靶点与慢性肺心病的治疗靶点取交集，最终得到45 个共同靶点，见图1。

图1 葶苈大枣泻肺汤与肺心病相关靶点韦恩图Fig. 1 Wayne chart of target of Tingli Dazao Xeifei decoction and heart failure

2.3 “药物-化合物-靶点”网络和蛋白互作网络的构建

“药物-化合物-靶点”网络见图2，该网络共包含73 个节点和362 条边，图中节点越大表明相互作用的节点越多，线条越多代表关联度越大。将“葶苈大枣泻肺汤-肺心病”45 个共同靶点导入STRING 蛋白质互作数据库，得到蛋白间的相互关系，继而构建共有靶点互相作用网络图，见图3。通过Network Analyzer 插件分析网络的拓扑学性质，伊夫双苷、毒毛旋花子苷元、毒毛旋花K、β-谷甾醇关联度较高，白介素-6（IL6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、AKT 丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、端粒逆转录酶（TERT）、雌激素受体1（ESR1）和基质金属蛋白酶2（MMP2）等靶点的关联度较大，表明这些活性成分与靶点肺心病治疗中可能发挥关键作用，体现出葶苈大枣泻肺汤是多成分、多靶点的网络体系。

图2 “药物-化合物-靶点”网络图Fig. 2 Network diagram of "drug-compound-target"

图3 45 个富集靶点的PPI 网络图Fig. 3 PPI network diagram of 45 enriched targets

2.4 GO 生物功能与KEGG 通路富集分析

将45 个共有靶点导入DAVID 数据库中进行GO基因富集和KEGG 通路分析。GO 生物学功能中，相关条目最多的是生物学过程（BP），主要涉及254 个相关条目包括erk1 和erk2 级联的正调节、基因表达负调控、MAPK 级联激活和基因表达正调控等；其次是分子功能（MF），主要涉及52 个相关条目主要包括同一蛋白结合、蛋白质结合、蛋白酪氨酸激酶活性和蛋白激酶活性等；最后是细胞组分（CC），主要涉及20 个相关条目包括细胞膜、受体复合物、细胞外空间和胞外区等。以P值作为筛选标准，分别选取P值最小的前10 条进行展示，富集结果见图4。

图4 葶苈大枣泻肺汤治疗肺心病的GO 富集分析Fig. 4 Analysis of GO enrichment of Tingli Dazao Xiefei decoction in the treatment of pulmonary heart disease

KEGG 富集分析共有79 条相关通路，取前20位的结果形成KEGG 功能富集气泡图，用基因个数、P值和gene ratio 来衡量富集程度，见图5。其中，P代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高；gene ratio 是目标基因集中在这个通路的基因比率，gene ratio 越大，表示富集程度越高。结果显示KEGG通路主要涉及缺氧诱导因子-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、cGMP-PKG 信号通路（cGMPPKG signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等79 条相关通路。

图5 葶苈大枣泻肺汤治疗肺心病的通路分析Fig. 5 Pathway analysis of Tingli Dazao Xiefei decoction in the treatment of pulmonary heart disease

2.5 分子对接验证

利用Autidock Vina 软件对6 个关键靶点蛋白及葶苈大枣泻肺汤中5 个关键药效成分进行分子对接验证，并记录分子与靶点的最低结合能，对接靶点及配体信息，见表2。葶苈大枣泻肺汤中关键药效成分与靶点蛋白结合普遍较好，均小于5 KJ/mol，其中，IL-6、VEGFA、TERT 等蛋白与伊夫双苷、毒毛旋花子苷元、毒毛旋花K、β-谷甾醇、左旋千金藤啶碱结合能较低，具有较强的结合能力，对接结果见表3、图6-图8。

图6 IL-6 与伊夫双苷（A）、毒毛旋花子苷元（B）、毒毛旋花K（C）、β-谷甾醇（D）、左旋千金藤啶碱（E）的分子对接结果Fig. 6 The molecular docking results of IL-6 and Erysimoside (A), Cynotoxin (B), K-Strophanthoside (C), β-Sitosterol (D) and Stepholidine (E)

图8 TERT 与伊夫双苷（A）、毒毛旋花子苷元（B）、毒毛旋花K（C）、β-谷甾醇（D）、左旋千金藤啶碱（E）的分子对接结果Fig. 8 The molecular docking results of TERT and Erysimoside (A), Cynotoxin (B), K-Strophanthoside (C), β-Sitosterol (D) and Stepholidine (E)

表2 对接靶点及配体信息Tab. 2 Docking target and ligand information

表3 葶苈大枣泻肺汤关键药效成分及靶点蛋白的分子对接作用结果Tab. 3 Results of molecular docking of key medicinal components and key targets of Tingli Dazao Xiefei decoction

3 讨论

肺心病症状早在《素问》中即有描述，如“肺痹者，烦满喘而呕”“肺之壅，喘而两胠满”“夫不得卧，卧则喘者，是水气之客也”[12]，由此可见中医讲肺心病从肺治的道理所在。本研究中葶苈子入肺经，主清肺祛痰，降气平喘，同时其活性成分有明显的强心作用[13]，大枣补中益气，有缓和肺气之功用，故两者合用十分适用于慢性肺心病的喘息水肿证，可视作慢性肺心病的有效药物。

图7 VEGFA 与伊夫双苷（A）、毒毛旋花子苷元（B）、毒毛旋花K（C）、β-谷甾醇（D）、左旋千金藤啶碱（E）的分子对接结果Fig. 7 The molecular docking results of VEGFA and Erysimoside (A), Cynotoxin (B), K-Strophanthoside (C), β-Sitosterol (D) and Stepholidine (E)

本研究基于网络药理学方法，筛选出葶苈大枣泻肺汤26 个潜在活性成分及45 个活性靶点，经分子对接验证，度值较高的前6 个关键靶点蛋白与5 个关键药效成分均显示出较强的结合能力，体现了葶苈大枣泻肺汤多成分、多靶点协同发挥作用的特点。研究表明，伊夫双苷、毒毛旋花子苷元、毒毛旋花K是葶苈子中强心苷类物质，能增强心室心肌泵血功能，增加冠脉流量，具有强心作用[14]。β-谷甾醇通过抑制IL-6 活性，减少炎症因子分泌，能够缓解肺组织损伤，同时具有镇咳祛痰、舒张支气管平滑肌的作用[15]。左旋千金藤啶碱能够增加心肌收缩力，缓解心衰症状[16]。由PPI 互作网络及分子对接验证，葶苈大枣泻肺汤治疗肺心病的核心靶点为：IL-6、VEGFA、AKT1、TERT、ESR1、MMP2。IL-6 是一种由多种细胞分泌的炎性因子，有研究发现，肺心病患者体内IL-6 含量明显高于正常志愿者，炎症反复可导致肺组织纤维化[17]。VEGFA 作为内皮生长因子，能够促进动脉壁平滑肌增生肥厚，导致血管弹性下降并血管腔狭窄，易引起肺动脉高压[18]。AKT1负责调控细胞增殖生长，能够加强表达促心肌细胞重构及纤维化，能够加重心衰病情[19]。TERT 是一类与癌症相关的逆转录酶，有研究发现，心衰患者体内TERT 含量明显升高，并随着心衰发病有一定波动[20]。由此可知葶苈大枣泻肺汤可能通过IL-6、VEGFA、AKT1、TERT 等靶点，发挥抗炎、抗心衰、减缓心肌纤维化等作用。

GO 功能及KEGG 富集分析可知，葶苈大枣泻肺汤治疗肺心病主要通过HIF-1 信号通路、cGMPPKG 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等通路。多项研究[21]表明HIF-1 能够控制氧的输送和利用，使心肌细胞达到氧稳态，对于心肌缺氧损伤细胞发挥保护作用。玄春花等[22]研究表明慢性肺心病可致cGMPPKG 信号传导中断，导致患者心肌肥厚、缩舒功能不全以及硬化等恶行病变。另有研究证明，PI3K/AKT 信号通路及通路中的众多受体和激酶与心力衰竭有着密切的联系，能够调控炎症细胞活化、炎性介质合成和释放，增强血管生成，抑制细胞凋亡因子[23]。

4 结论

本研究基于中医整体观念和现代整合药理学思路，对葶苈大枣泻肺汤治疗肺心病的潜在活性成分、作用靶点及相关通路等进行初步探讨及验证筛选，结果表明伊夫双苷、毒毛旋花子苷元、毒毛旋花K、β-谷甾醇、左旋千金藤啶碱等潜在活性成分可能通过HIF-1 信号通路、cGMP-PKG 信号通路、PI3K-Akt等信号通路作用于IL-6、VEGFA、AKT1、TERT、ESR1、MMP2 等核心靶点，共同发挥抗炎、增强心肌作用、保护肺心功能等作用，为深入研究葶苈大枣泻肺汤治疗肺心病的活性成分及机制提供了一定的科学基础及理论依据。