基于分子对接技术探讨中药抑制幽门螺旋杆菌脲酶(HPU)活性的物质基础及规律

欧海亚，叶小鹏，徐旖琪，刘嘉辉，邝卫红

（1. 广州中医药大学附属宝安中医院，广东 深圳 518133；2. 广东医科大学 第二临床医学院，广东湛江 524000 ；3. 中山大学附属第一医院 中医科，广东 广州 510080）

幽门螺旋杆菌是一种微需氧的革兰氏阴性细菌，因其具有传染性强的特点也被归属于传染病范畴[1]。幽门螺旋杆菌主要定植在人的胃粘膜，通过产生大量脲酶（Helicobacter pyloriurease，HPU）促进其表面形成保护性液膜并催化尿素产生氨中和胃酸，使其能够适应胃部强酸环境并存活。此外，HPU可通过增强胃黏膜的通透性和破坏胃壁细胞发挥毒力作用，故被认为是幽门螺旋杆菌在胃内存活及致病的关键蛋白[2]。

目前，我国已有超过50%的人感染幽门螺旋杆菌。临床研究表明，幽门螺旋杆菌是慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等消化道疾病的重要致病因素，也是一类致癌因子[3]。因此，及时、彻底地根除幽门螺旋杆菌可在一定程度上降低上述疾病发生的概率。目前，国内共识推荐的首选治疗方案为经验性使用含铋剂的四联抗幽门螺旋杆菌根除方案，但因抗生素耐药性、药物副作用等因素导致根除成功率逐渐下降[1-4]，因此研发高效低毒的优化方案根除幽门螺旋杆菌是目前亟需攻克的问题。

中药是天然的化合物宝库，具有成分多、作用平稳、安全性较高等特点，辨证论治使用中药治疗胃肠道疾病效果较佳，且多项研究显示中药及复方具有提高幽门螺旋杆菌的根除率以及减少抗生素副作用的功效[5-7]，这表明中药可为抗幽门螺旋杆菌方案的优化提供潜在选择，而HPU 是幽门螺旋杆菌存活及致病的关键蛋白，因此挖掘具有抑制HPU 活性作用的单体、中药、复方对药物研发以及发挥中医药抗幽门螺旋杆菌优势具有重要的价值。然而，目前通过实验或临床研究发现的具有抑制HPU 活性的中药及单体较少，加之中药及所含化合物数量巨大，逐一成分研究则存在研究周期长、资金成本大等问题，故暂无有关系统评估及挖掘可抑制HPU 活性的中药单体、中药及中药组方等方面的研究。

分子对接是一种普遍应用于药物设计的技术，可通过模拟计算配体受体间亲和力以及结合模式从而评估相互作用可能性大小以及复合物之间的稳定性，进而实现识别苗头分子及筛选分子等功能，目前广泛用于发现及优化先导化合物等领域[8-9]。本研究基于分子对接的方法，拟初步筛选出具有抑制HPU 活性潜能的中药小分子及相关中药，阐述中药抑制HPU 活性的潜在物质基础以及一般规律，为进一步开发可靠的中药先导化合物以及针对幽门螺旋杆菌感染相关疾病的临床用药提供思路以及理论依据。

1 材料与方法

1.1 中药小分子化合物的获取以及小分子配体数据库的构建

本研究通过检索中药系统药理学技术平台TCMSP 数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）, 获取其所收录的小分子化合物信息并下载所有小分子的三维结构*.MOL2 格式文件。筛选出符合口服利用度（Oral bioavailability, OB）≥30%且类药性（Drug likeness, DL）≥0.18 两个条件的小分子化合物用以构建中药小分子配体数据库。借助Autodock tools 1.5.6软件将配体数据库中的小分子计算电荷后保存为*. pdbqt 格式文件。

1.2 靶点分子结构的获取及预处理

通过PDB 数据库(www.rcsb.org/)下载HPU 的X射线晶体结构（PDB 代码：1E9Y，分辨率为3.00Å），借助Pymol 1.7.X 软件及Autodock tools 1.5.6 软件将1E9Y 中原有小分子配体删除并去掉水分子，经添加极性氢、合并非极性氢、赋予电荷优化晶体结构后保存为*.pdbqt 格式文件。

1.3 构建对接模型及分子对接

借助分子对接软件Autodock Vina 将HPU 与配体数据库中的小分子进行分子对接，并获取各配体的结合能（Affinity）打分，其中，对接结合能打分是Autodock Vina 软件基于半经验半自由能的打分方法，该值与结合强度呈负相关关系[10]。研究表明HPU 催化活性区域以镍离子（Ni2+）为中心，包含多个氨基酸残基及水分子，故本次分子对接将对接活性口袋Grid box 坐标中心设置为两个镍离子坐标的平均值[11]，活性口袋大小设置为（30, 30, 30），格点间隔则设置为默认值[12-13]。对接过程中每个小分子化合物均获取20 种构象，选取各受体-配体结合最佳结合的构象（结合能最低）作进一步分析，并借助Discovery Studio 2016 Visualizer 软件进行可视化。

1.4 构建候选化合物-中药网络以及整理并统计中药数据信息

以最低结合能小于等于-8 Kcal/mol 为阈值进一步筛选出与HPU 结合潜力大的中药小分子，将其定义为候选化合物，并从TCMSP 数据库中匹配出含有候选化合物的中药。通过软件Cytoscape 3.6.1 构建候选化合物—中药网络并分析网络中各节点（node）的度值（degree）。通过查询卫生部“十二五”规划教材 《中药学》[14]以及从《中国药典》（2020 年版）获取中药的归经以及性味等信息并进行频数统计，初步探索抑制HPU 活性的一般规律。

2 结果及分析

2.1 化合物获取结果

通过检索 TCMSP 数据库共获取中药小分子化合物13 724 个及相关中药502 味，以OB ≥30%及DL ≥0.18 为条件进行筛选后，共纳入配体数据库的中药小分子为2 583 个。将配体库中的小分子与HPU 进行分子对接后，发现配体库中各小分子最低结合能介于-9.50 ～-4.00 Kcal/mol 之间，中位数为-6.7 Kcal/mol，配体库中的小分子最低结合能分布情况详见图1。

图1 配体最低结合能分布图Fig. 1 Distribution of the lowest binding energy of the ligand

2.2 候选化合物对接结果

以最低结合能≤-8 Kcal/mol 为界限，共筛选出候选化合物99 个，其中，最低结合能由低至高排前6 的小分子化合物为（E, E)-3, 5-Di-O-caffeoylquinic acid、bisindigotin、mulberrofuran G、6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one、procyanidin B-5, 3'-O-gallate、chaksine，其分值依次为-9.5 Kcal/mol、-9.1 Kcal/mol、-9.1 Kcal/mol、-8.9 Kcal/mol、-8.9 Kcal/mol、-8.9 Kcal/mol，将结合能最低的6 个配体-受体复合物进行可视化如图2 所示。图中显示六种中药小分子均能稳定的对接到HPU 的活性口袋中，对接2D 结构示意图显示配体小分子除可与HPU 活性口袋周围Asp223、Ala365、Thr171、Cys321 等氨基酸残基形成氢键作用外，亦可形成静电作用及疏水作用，由此提示结合能低的分子可与HPU 形成多种相互作用力而具有潜在的抑制作用，可供进一步开发研究。从 TCMSP 数据库中匹配出候选化合物相关中药104 种，其中，最低结合能≤-8.6 Kcal/mol 的候选分子及所匹配的中药，见表1，可知续断、蓼大青叶、青黛、桑白皮、板蓝根、大青叶等中药含与HPU 结合能低的小分子，提示这些中药潜在抑制HPU 活性从而具有抗幽门螺旋杆菌前景，可供临床治疗幽门螺旋杆菌感染相关性疾病提供借鉴。

表1 部分候选分子信息（最低结合能≤ -8.6 Kcal/mol）及相关的中药Tab. 1 Some of the candidate molecules（Affinity ≤-8.6 Kcal/mol）and related Chinese medicines

图2 6 个结合能最低的配体-受体复合物作用模式图Fig. 2 Diagram of the action mode of the 6 ligand-receptor complexes with the lowest affinity

2.3 候选化合物-中药网络的构建与分析

将候选化合物以及中药导入Cytoscape 3.6.1 软件后得候选化合物-中药网络，网络中共有203 个节点（node），其中候选化合物节点有99 个，中药节点104 个，如图3 所示，图中绿色六边形为候选化合物节点，淡红色菱形为中药节点，图中各节点大小与度值成正相关关系。中药节点度值排前4 的为白屈菜、苦地丁、甘草、洋金花，分别含有6、6、5、5 个候选化合物，其中，度值前16 的中药如表2 所示,这些中药所含候选化合物较多，提示这些中药具有多成分协同抑制HPU 活性的潜力。

图3 候选化合物-中药网络图Fig.3 Interactional network of candidate compounds and Chinese medicines

表2 候选化合物-中药网络中部分中药节点度值表（度值前16）Tab. 2 Degree of herb nodes in the network of candidate compoundsherbs (degree top 16)

2.4 中药性味与归经统计结果分析

通过收集候选化合物相关中药的性味归经等信息并进行频数统计从而分析中药的一般规律，其中，了哥王根、茄根、葎草、马尾莲等4 味中药暂未被《中药学》及《中国药典》所收录，故暂不予以纳入统计。中药性味归经统计结果详见表3 和图4，其中，表3 显示潜在抗幽门螺旋杆菌的中药药味最高频率为苦味，为39.43%，其次为甘味、辛味，此三种药味累计频率可达89.43%；药性方面以寒性中药数目最多，频率为47.80%。就归经而言，排前四的经络归属依次为肝、肺、胃、脾，出现频率为20.84%、19.26%、16.62%、10.82%，累计达67.55%。频数分析结果显示，通过抑制HPU 活性实现抗幽门螺旋杆菌作用的中药以苦寒药物居多，且其抑制作用的实现不仅与脾经、胃经相关，还与肝、肺二经关系紧密。

表3 中药的性味分布表Tab. 3 Distribution diagram of the property and flavor of Chinese medicines

图4 药物经络归属分布图Fig. 4 Distribution diagram of channel attribution

3 讨论

HPU 是一种含Ni2+的金属酶，是幽门螺旋杆菌存活及致病的关键蛋白，其发挥催化尿素的功能主要依赖于以Ni2+为中心的活性区域，但同时也与活性中心上方控制底物出入的flap 区域有关[15]。研究表明flap 区域中多种重要残基如Cys321、His322、His221、Met366、Asp362、Alal69、Asnl68、Ala365负责氢键作用[16]，其中，Cys321 残基则是影响flap区域的一个重要基团[17]。而HPU 活性中心则包含2 个Ni2+原子，2 个水分子以及His136、His248、His274、His138、Kcx219、Asp362 等氨基酸残基[13]。分子对接结果显示MOL011100、MOL012726、MOL001810、MOL002260、MOL004450 等小分子可与flap 区域周围的Cys321、Ala365、Asp362、Ile220、Thr171 等残基形成潜在的氢键作用，与flap区域周围的Asp223、Ala365、Thr171、Cys321 等残基形成疏水等多种作用力，这表明上述候选化合物具有作用于flap 区域的潜力，通过多样的分子间作用力在flap 区域与HPU 形成复合物从而减少或阻断尿素出入。此外，MOL009312 等候选化合物也可与活性中心的Asp362、His248 等多个残基形成氢键、范德华力等作用力，提示部分中药小分子也可竞争性进入酶活性中心，改变HPU 活性区域构象从而降低其催化活性。就中药而言，含有与HPU 结合能力较佳的候选化合物的中药具有抑制HPU 活性的潜能，从而能对幽门螺旋杆菌产生抑制作用。其中，黄连、黄芩、大黄、党参、延胡索、胡椒、白屈菜已被证明对幽门螺旋杆菌具有较强的抑制作用，与本研究的预测结果相符，提示本研究借助分子对接的方法筛选出的具有抑制幽门螺旋杆菌潜能的小分子及中药可信度较高，值得进一步探索和开发[5]。

候选化合物-中药网络中，白屈菜及苦地丁含有较多的候选化合物，提示这两种中药在抗幽门螺旋杆菌方面具有较好的临床应用前景，可进一步挖掘。研究发现，白屈菜及苦地丁的主要成分为生物碱，苦地丁含有黄连碱，而白屈菜则含有黄连碱以及小檗碱，这两种生物碱均对幽门螺旋杆菌敏感且对 HPU 活性抑制能力较强[18-19]，这也对本研究中分子对接筛选出的中药具有抑制幽门螺旋杆菌的潜能提供了证据支持。值得注意的是，这两种中药中仍有多种生物碱与HPU 的结合能低于黄连碱及小檗碱，但暂无这些小分子抑制 HPU 活性的相关报道，这也是今后可以进一步探索的方向。此外，大黄、甘草、两面针等度值较高的中药对幽门螺旋杆菌的抑制作用均已得到验证[20]，可为临床辨证施治提供药理依据。同时，度值高的中药含有多种潜在有效成分，提示这些中药具有多功能物质协同作用的特点，可降低使用单一成分产生的耐药率，多种有效成分协同抗菌亦可减少单一药物用量从而降低毒副作用。由此可知，中药在抑制幽门螺旋杆菌方面具有多功能协同作用的优势。

性味归经频数统计，结果显示，具有潜在抑制HPU 活性的中药中，从性味方面而言，苦、甘、辛三种药味共占89.43%，其中，苦能燥、能泻，具有燥湿以及通泻、降泻、清泻的功效，甘能补、和、缓，具有和中补益的功效，而辛味药具有发散、行气血的功效，以药测证可初步推测出幽门螺旋杆菌感染相关疾病中出现较频繁的证素为热、湿、虚、气滞、血瘀；从归经方面而言，包含候选化合物的中药归肝、肺、脾、胃经居多，其中，肝、肺二经协调对调畅全身气血至关重要。综上所述，由用药规律可推测感染幽门螺旋杆菌后，辨证施治应着重清热、调理气血及脾胃。

4 结论

本研究从蛋白水平出发，将 HPU 作为研究靶点，借助分子对接技术预测小分子与靶点之间的作用模式，筛选出具有抑制 HPU 活性潜能的候选化合物及其对应的中药，并系统地探讨了中药抑制 HPU 活性的潜在物质基础及一般规律，可为中西医结合临床辨证用药提供理论依据，以及为进一步挖掘抗幽门螺旋杆菌药物提供方向，具有重要的研究意义。然而，本研究数据主要从数据库以及分子模拟计算获得，暂未考虑数据库收录是否全面、最低抑制剂量、抑制强度以及中药煎煮方式等因素对结果所带来的影响，因而仍需进一步实验或临床验证。