长双歧杆菌F16的鉴定及益生性研究

冯诗诗，惠 明*，杨林英，田 青，胡 军

1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

2.郑州大学 基础医学院，河南 郑州 450001

人体肠道菌群的稳定是机体正常生理代谢和免疫体系的重要保障[1]，其中长双歧杆菌是肠道中的一个重要菌群[2]，具有抵抗病原微生物，提高机体免疫力[3-4]，调节肠道微生物[5]，保护肠道屏障的完整性[6]，预防腹泻、便秘、食物过敏等[7-8]功能，与机体健康密切相关。双歧杆菌益生作用的主要机制是耐受胃酸和胆汁、可产生乳酸降低肠道pH值抑制致病菌的生长[9-10]、可降解胆固醇[11-13]等。此外，双歧杆菌对肠道上皮细胞具有黏附性，能刺激机体的免疫反应[14]，以此来保护宿主，增强NK细胞的杀伤能力，促进B淋巴细胞的分化，竞争空间和营养来抵御病原微生物[15]、提高机体的抗肿瘤免疫能力、抑制肿瘤细胞的扩散、推进抗PD-L1肿瘤免疫疗法的疗效[16]。目前，国内对双歧杆菌的研究大多都是未经驯化的厌氧菌株，由于耐氧驯化较为复杂，且驯化过程漫长，对耐氧双歧杆菌的研究相对较少。双歧杆菌是严格的厌氧菌，日常保存和培养中菌株会与氧气有不同程度的接触，造成氧中毒，限制其进一步的研究与应用。对郑州大学基础医学院胡军实验室经长期传代保存的益生菌菌样，通过16S rRNA测序及构建系统发育树分离鉴定菌种为长双歧杆菌，将该菌株标记为F16，用其发酵豆浆，发现比未驯化的长双歧杆菌凝固豆浆所用时间更短，对其进行穿刺培养，发现菌株只沿穿刺线生长且形成的穿刺线粗而散，表明该菌株对氧气具有一定的耐受性，菌株其他性能未知，为探究耐氧性双歧杆菌的益生性能，采用高效液相色谱法、比色法、平板计数法、模拟胃肠道环境等方法对F16的降胆固醇能力和耐受性能等益生价值进行研究，为新一代益生性产品的开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种来源：菌样由郑州大学基础医学院胡军实验室提供。

琼脂、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温-80、磷酸氢二钾、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰(BC)等：天津市大茂化学试剂厂；Ezup柱式细菌基因DNA 抽提试剂盒、琼脂糖、胆固醇、牛胆酸钠等：生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶(BR)：源叶生物有限公司。

1.2 仪器与设备

ZHJH-C1109B型超净工作台：上海智诚分析仪器制造有限公司；BK 5000型光学显微镜：奥特光学仪器有限公司；YQX-II厌氧培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；JY600D电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；PCR仪：上海仪涛生物有限公司；高效液相仪系统：株式会社岛津制作所；紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种分离

取菌样，稀释涂布，待长出纯菌株后，挑取单菌落划线，37 ℃厌氧培养72 h(第1次活化时间较长，为5～7 d)，传代至菌株形态稳定，标记为F16。

1.3.2 形态学鉴定

观察菌株的形态特征，并记录。进行革兰氏染色，观察结果。

1.3.3 生理生化鉴定

过氧化氢酶试验：使用3%～5%的过氧化氢溶液测定。

糖发酵试验：乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、核糖、硝酸盐还原。与空白对照相比，若培养基保持原色，则表明菌株F16不能利用该糖，用“-”表示；若培养基变黄色，则表明菌株F16能分解该糖并产酸，用“+”表示。

果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)测定：果糖-6-磷酸酮酶是双歧杆菌属的特征性酶，在已糖代谢中，能够裂解果糖-6-磷酸，从而产生乙酸和乳酸。借用高频声波破坏双歧杆菌细胞，使得果糖-6-磷酸酮酶暴露出来，然后加入底物果糖-6-磷酸及指示剂，用分光光度计观察颜色变化可以初步鉴定双歧杆菌。具体操作参照文献[17]。

1.3.4 分子生物学鉴定

菌株F16基因组DNA的提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒中说明书步骤进行。利用PCR扩增其16S rRNA基因片段[18]，设置一个空白对照，以此来判断操作过程是否染菌。参照文献[19]进行琼脂糖凝胶电泳试验，获得一条约1 500 bp的单一透明条带，送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1.3.5 代谢产物乳酸含量测定

采用杨钰昆等[20]优化的高效液相色谱法，在该测定方法的基础上，改用ZORBAX SB-C18色谱柱，以0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液作流动相，测定发酵液中乳酸含量。

1.3.6 胆固醇降解试验

吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL胆固醇标准液于试管中，分别加入无水乙醇和显色剂，显色后30～40 min，在560 nm处读取吸光度，标准曲线的绘制参照文献[21]。将过滤除菌后的10.0 mg/mL的胆固醇溶液按1% 加入MRS培养基中，使胆固醇最终添加量为0.1 mg/mL，分别加入1%和5%的菌悬液，分别在培养48、72 h后测定胆固醇降解情况。具体测定方法参照文献[22]。

1.3.7 耐酸性试验

取菌悬液0.1 mL，注入含有2 mL PBS的pH值分别为1、2、3、4的50 mL具塞比色管中，37 ℃厌氧培养，并分别于0、2、4、6、8 h测定OD600，每组重复测3次取平均值。

1.3.8 耐胆盐试验

取菌悬液0.1 mL注入含0、1%、2%、3%牛胆酸钠的液体培养基，吐温-80含量为1.5%，分别于0、2、4、6、8 h测定OD600，每组重复测3次取平均值。

1.3.9 对人工胃肠液的耐受性试验

参照文献[22]中的方法配制人工胃液和肠液，等比例混合，以此来模拟胃肠道环境。将1 mL菌悬液与9 mL的混合液摇匀，37 ℃、120 r/min摇床振荡培养3 h，分别于0 h和3 h取样，稀释涂布及培养，平板计数，计算其存活率。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

菌株镜检结果如图1所示。菌落边缘整齐，表面凸起且光滑，不透明，呈乳白或灰白色。传代2～3次后，显微镜下观察，发现该菌为革兰氏阳性菌，菌体呈棒槌状排列、无芽孢，并且随着传代次数增加其逐渐呈现细丝状。

图1 F16菌株形态学鉴定结果(放大100)

2.2 生理生化鉴定结果

过氧化氢酶试验：过氧化氢溶液中不产气泡，试验结果呈阴性，表明菌株F16不产过氧化氢酶。

糖发酵试验：蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖试验呈阳性，硝酸盐还原试验呈阴性，表明菌株F16能够分解利用蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖，并产酸。

果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)测定：在试验最后添加含三氯化铁的盐酸后，体系变为红色，表明菌株F16为F6PPK阳性。

2.3 分子生物学鉴定结果

菌株F16的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳之后，将凝胶置于成像系统下观察发现其目的菌株的扩增产物在1 500 bp左右处有单一且明亮的条带，其空白对照则无，具体见图2。

注：从左至右依次为DNA Marker D、空白对照、PCR扩增产物。

将F16菌株的16S rRNA基因检测拼接序列输入美国国家生物技术信息中心(National center for biotechnology information, NCBI)官网中的Nucleotide BLAST数据库进行比对，再将比对结果通过MEGA软件进行F16菌株16S rRNA系统发育树建立(图3)。结果表明与该序列相似度高的相关菌株均为双歧杆菌属，系统发育树分析得出该菌与NR 117506.1(Bifidobacteriumlongumstrain KCTC 3128)和NR 044691.2(Bifidobacteriumlongumstrain ATCC 15707)处于同一分支上，同源性达99%以上，故亲缘关系最近。结合菌落、菌体、生理生化等特征，可初步确定该菌为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。

图3 F16菌株16S rRNA系统发育树

2.4 代谢产物乳酸含量测定结果

乳酸标准溶液色谱检测分析结果见图4，由图4可知，乳酸标准品在5.795 min处出峰。乳酸标准曲线的绘制参照文献[23]，根据不同浓度的乳酸标准品测得的峰面积结果制作乳酸标准曲线，该曲线的横坐标是乳酸标准品含量(mg/mL)，纵坐标是峰面积，回归方程为y=126.740 0x-0.622 9，回归系数(0.999)大于0.99，具有统计学意义。结果表明，乳酸含量在0.05～1 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图4 乳酸标准溶液色谱图

发酵液在5～6 min之间出现的峰面积为134 752；将数值代入乳酸标准曲线的回归方程，得出结果再乘以稀释倍数(10倍)算得发酵液中乳酸含量为10.63 mg/mL。

2.5 胆固醇降解试验结果

以胆固醇含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，参照2.4中的绘制方法，制作胆固醇标准曲线。胆固醇标准曲线的回归方程为y=0.430 1x+0.003 0，回归系数(0.998)大于0.99，具有统计学意义。

最初培养基中胆固醇添加量为0.1 mg/mL,由表1可知，48 h和72 h后其含量显著降低，降解率分别为46%和73%，说明菌株有明显降解胆固醇的作用，1%和5%接种量的样品降解率相差较小，降解效果差异不显著，说明少量菌株即可达到高效的降解。

表1 长双歧杆菌降解胆固醇情况

2.6 耐酸能力

益生菌被机体摄入后，进入胃肠道发挥作用，而胃液pH值通常在2以下，因此对菌株进行耐酸性测试十分重要。由图5可知，菌株F16活性由高到低的酸性环境依次为pH 4、pH 3、pH 2、pH 1，在pH 1、2、3、4的不同酸性环境中，2 h菌株活性分别下降了20.75%、17.50%、13.33%、4.27%，8 h菌株活性分别下降了36.70%、36.25%、22.35%、19.93%。菌株耐酸能力中等偏上。

图5 长双歧杆菌耐酸情况

2.7 耐胆盐能力

由图6可知，前6 h菌株F16活性上升相对较快，8 h在0、1%、2%、3%的胆盐条件下菌株活性分别上升了72.89%、77.27%、95.31%、83.33%，说明胆盐含量高的环境中菌株生长情况较好，两者基本呈正相关。通过查阅文献[24-25]发现，严格厌氧的双歧杆菌在高胆盐条件下，生长曲线平缓并有下降趋势，而菌株F16仍能正常增长，表明菌株对胆盐的耐受能力较高。

图6 长双歧杆菌耐胆盐情况

2.8 人工胃肠道耐受能力

模拟人胃肠道环境，仅有10-5和10-6的菌落数在30～300之间，分别是156(0 h)、125(3 h);113(0 h)、102(3 h)，其他梯度均不符合计数要求，故存活率参考这两个梯度。10-5的存活率为80.13%，10-6的存活率为90.27%，取其平均值可得到菌株F16在胃肠道内3 h存活率为85.20%。存活率较高，证明该菌株在人胃肠道内可保持较强活性，能充分发挥益生效用。

3 结论

通过16S rRNA序列分析、构建系统发育树等方法鉴定菌株F16为长双歧杆菌菌属(Bifidobacteriumlongus)。益生菌的抑菌机制是通过产生有机酸等代谢产物，调节胃肠道环境，降低胃肠道内的pH值，来抑制致病菌等的生长。长双歧杆菌F16将碳水化合物发酵成乳酸，抑制致病菌的生长及活性，达到调节胃肠道微生物平衡的目的。采用高效液相色谱法测定了长双歧杆菌F16的代谢产物乳酸含量为10.63 mg/mL，乳酸产量较为可观，具有较好的抑菌性。采用比色法测定长双歧杆菌F16对酸度和牛胆酸钠的耐受性，在不同酸度环境下，8 h菌株活性分别下降了36.70%(pH 4)、36.25%(pH 3)、22.35%(pH 2)、19.93%(pH 1)，菌株生长所受影响较小；不同的胆盐含量(0、1%、2%、3%)条件下，8 h菌株活性分别上升了72.89%、77.27%、95.31%、83.33%，说明胆盐能在一定程度上协同该菌株的生长。该菌株的耐酸能力中等偏上、耐胆盐能力极好。

比色法测定长双歧杆菌F16的降胆固醇能力，胆固醇的最佳测定时间是溶液显色后30～40 min，最大吸收波长是560 nm，菌株对胆固醇的降解率较高(46%～75%)，证明菌株降解胆固醇的能力较强，72 h的降解率显著高于48 h。此试验为体外试验，在碳源、氮源充足，温度、pH值等条件适宜的基础上，降解胆固醇效果非常显著；但将菌株制成制剂等益生产品，进入人体后，由于生产和储存过程中的条件、周围环境及胃肠道环境的不同可能会对益生效果产生影响。模拟人胃肠道环境，菌落计数法测得菌株在模拟环境中3 h的存活率为85.20%。综上所述，耐氧长双歧杆菌F16具有良好的耐受性能、降胆固醇能力以及在胃肠道环境中具有较高活性，是1株优秀的益生菌，对于开发益生菌制品具有重要应用价值。