血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平预测卵巢癌患者预后的临床价值

裴 培，郭春莲，高丹凤

上海市同仁医院妇产科，上海 200050

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，由于位置较深，没有特异性的检测手段，确诊时70%以上的患者已经发展为晚期，其5年生存率为30%～40%，因此要改善患者的预后，早发现、早诊断和早治疗显得尤其重要[1-2]。微小RNA(miRNA)是一种转录后的调控因子，在肿瘤的发生、发展和预后均有很重要功能，现有研究证实肿瘤的发生、发展与miRNA的失衡具有重要联系[3-4]。现有研究证实，miR-221-3p参与了多种肿瘤的发生、发展，在卵巢癌患者的血清中出现异常增高[5]，而在肿瘤的临床病理和预后方面的研究甚少。miR-451a在多种肿瘤中出现异常表达，对肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移具有明显的抑制作用，同样发现在卵巢中出现低表达[5]，与miR-221-3p相对表达水平是否具有内在联系仍不清楚。本研究通过检测卵巢癌患者血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平，观察其在卵巢癌预后中的临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2017年12月在本院就诊且病理诊断为卵巢癌的患者110例(卵巢癌组)作为研究对象。卵巢癌患者年龄为45～79岁，平均(61.54±8.65)岁；按照病理类型分为浆液性腺癌57例，非浆液性腺癌53例；按照分化程度分为低分化18例、中分化68例和高分化24例；按照国际妇产科协会(FIGO)分期分为Ⅰ期13例、Ⅱ期35例、Ⅲ期45例和Ⅳ期17例。选取同期在本院经病理证实的良性卵巢肿瘤患者75例作为卵巢良性组，年龄为45～79岁，平均(61.38±6.75)岁。选取同期在本院行体检的女性健康者45例作为健康对照组，年龄为45～79岁，平均(60.96±5.81)岁。纳入标准：(1)卵巢癌组和卵巢良性组均经病理证实；(2)均为初次就诊；(3)所有的患者均未接受放化疗；(4)均知情同意，签署知情同意书；(5)经医院伦理委员会审核通过。排除标准：(1)患其他恶性肿瘤；(2)患血液性和免疫性疾病；(3)患肝炎、结核和急慢性肺炎等感染性疾病；(4)患严重的内科疾病。各组年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1随访 所有卵巢癌患者均接受随访3年，根据患者是否死亡分为生存组(79例)和死亡组(31例)。

1.2.2血液标本保存和检测 卵巢癌组入院后和手术后1周抽取肘静脉血2 mL。采用离心机将血液离心，离心半径15 cm，离心速度3 000 r/min，离心15 min，抽取上清液放置在除酶管内，放置在-70 ℃冰箱中保存。

1.2.3实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR) (1)总RNA抽取：采集受试者血清400 μL，采用TaqMan miRNA试剂盒提取血清总RNA，反转录引物由上海化生有限公司合成。miR-221-3p上游引物序列为5′-CCT GAG ATG CAG GGT CCG AGG TAG GTC TA-3′，下游引物序列为5′-TTG CGG ACA TTG CTT GCT A-3′。miR-451a上游引物序列为5′-ATT GCT TGT CTC GGT CTG-3′，下游引物序列为5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG CTT ACA G-3′。U6的上游引物为5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物为5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。(2)miRNA检测：选择反转录酶1 μL，RNA5 μL和3 μL引物，在15 μL的反应体系中，采用美国ABI TaqMan PreAmp Master Mix进行扩增，扩增条件：16 ℃30 min，42 ℃反应30 min和85 ℃反应5 min。取反转录配制20 μL反应体系，放置在荧光定量仪中进行反应，反应条件为95 ℃预变性15 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，连续40个循环。每个样品检测3次，以2-ΔΔCt表示。

1.3观察指标 观察各组血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平的变化，卵巢癌组血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平在术前和术后的变化，以及其与临床指标[年龄、肿瘤最大径、组织分型、分化程度、FIGO分期、淋巴结转移、糖类抗原125(CA125)]和预后的关系。

2 结 果

2.1各组血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平比较 卵巢癌组血清miR-221-3p相对表达水平明显高于卵巢良性组和健康对照组,而卵巢良性组血清miR-221-3p相对表达水平高于健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);卵巢癌组术后血清miR-221-3p相对表达水平较术前明显降低,差异有统计学意义(t=11.785，P<0.05)。卵巢癌组血清miR-451a相对表达水平较卵巢良性组和健康对照组明显降低，而卵巢良性组血清miR-451a相对表达水平明显低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05);卵巢癌组术后血清miR-451a相对表达水平较术前明显升高，差异有统计学意义(t=10.833，P<0.05)。见表1。

表1 各组血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平比较

2.2卵巢癌组血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平与临床指标的关系 卵巢癌组血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平在不同肿瘤最大径、分化程度、FIGO分期、淋巴结转移和CA125水平患者间比较，差异有统计学意义(P<0.01)，而在不同年龄和组织分型患者间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 卵巢癌组血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平与临床指标的关系

2.3卵巢癌患者血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平之间的相关性 卵巢癌患者血清miR-221-3p相对表达水平与血清miR-451a相对表达水平呈负相关(r=-0.648，P<0.01)。

2.4卵巢癌患者随访3年血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平与预后的关系 卵巢癌组术后随访3年，生存组血清miR-221-3p相对表达水平明显低于死亡组，差异有统计学意义(P<0.05)，而生存组血清miR-451a相对表达水平明显高于死亡组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 生存组和死亡组血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平比较

2.5联合检测在预测患者3年内出现死亡的效能分析 血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平在预测卵巢癌患者3年内出现死亡具有较高的效能，根据患者3年内是否出现死亡进行Logistics回归得方程Y=2.46×XmiR-221-3p-2×XmiR-451a-4.49得联合检测指标，联合检测其灵敏度为87.1%，特异度为91.1%，两者联合检测的ROC曲线下面积(AUC)为0.929，明显高于miR-221-3p(Z=2.016，P<0.05)和miR-451a(Z=2.543，P<0.05)单项检测的AUC，而血清miR-221-3p和miR-451a的AUC比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表4。

图1 联合检测在预测卵巢癌患者3年内出现死亡的AUC比较

表4 联合检测在预测患者3年内出现死亡的效能分析

3 讨 论

卵巢癌由于位置在盆腔的深部，早期没有明显的症状，多数患者在确诊时已经是晚期，5年存活率较低。卵巢癌患者预后差的重要因素是早期诊断较为困难，并且化疗容易耐药和容易出现复发。目前诊断卵巢癌的常规方法主要有经阴道超声、盆腔CT和CA125，但由于这些检查方法的灵敏度和特异度较低，对于早期发现卵巢癌的临床价值受限[6]。现越来越多的研究表明循环中的miRNA在临床多种肿瘤的诊断和预后判断中具有重要的临床价值，与肿瘤的发生、发展和转移同样具有密切相关性，在卵巢癌诊断和预后判断方面同样具有极高的临床价值。

miR-221-3p是一个重要的促癌基因，在多种肿瘤如宫颈癌、前列腺癌、胃癌和胰腺癌等呈高表达，且其相对表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关。miR-221-3p通过靶向THBS2的表达，促进宫颈鳞状细胞癌的血管生成，促进宫颈癌的迁移和浸润[7]；在前列腺癌的研究中发现miR-221-3p促进SOX4的表达，促进肿瘤的增殖和转移[8]。在胃癌中的研究中表明血清miR-221-3p相对表达水平与肿瘤分期和淋巴转移密切相关，在胃癌的预后预测中具有重要临床价值[9]；在胰腺癌的研究中发现miR-221-3p相对表达水平明显升高，是胰腺癌潜在的生物学指标[9]。本研究发现卵巢癌组血清miR-221-3p相对表达水平明显高于卵巢良性肿瘤组和健康对照组，卵巢癌组术后血清miR-221-3p相对表达水平较术前明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)，说明血清miR-221-3p来自肿瘤部位，与肿瘤具有密切相关。有研究显示miR-221-3p能够通过调节ARF4靶基因的表达，从而促进内皮卵巢癌的增殖和迁移[10]。本研究结果显示，血清miR-221-3p相对表达水平在不同肿瘤最大径、分化程度、FIGO分期、淋巴结转移和CA125水平卵巢癌患者间比较，差异有统计学意义(P<0.01)，说明血清miR-221-3p相对表达水平反映卵巢癌的恶性程度和肿瘤的分期，与文献[11]报道结果类似。本研究显示，当血清miR-221-3p相对表达水平>2.73时，其预测3年内发生死亡的灵敏度为77.4%，特异度为84.8%，而AUC为0.859，说明血清miR-221-3p相对表达水平在预测卵巢癌预后具有较高的价值。

miR-451a近年来研究较多的miRNA之一，与多种肿瘤的生物学行为具有密切关系。在肝癌的研究中发现miR-451a能够通过干扰YWHAZ基因的表达，对FOX03蛋白细胞核内的聚集进行调节，从而抑制肿瘤的生长[12]；在胰腺癌的研究发现miR-451a能够作用于CDKN2D和MAP3K1靶基因，从而抑制肿瘤细胞的增殖[13]；miR-451a可以通过干扰CCND2基因的表达，抑制细胞增殖和迁移，促进乳腺癌的细胞凋亡，改善对肿瘤细胞的耐药性，并发现miR-451a可以作为乳腺癌预后的预测因子，对乳腺癌的预后具有预测作用[14]；在另一项研究证实转染miR-451a后，对胃癌和结直肠癌细胞株的增殖、分化和转移具有明显抑制作用，对细胞凋亡具有促进作用，从而抑制肿瘤的发生、发展[15-16]。本研究表明卵巢癌患者血清miR-451a相对表达水平明显低于卵巢良性组和健康对照组，卵巢癌组术后血清miR-451a相对表达水平较术前明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明miR-451a对卵巢癌具有保护作用，是一种抑制基因，与文献[17]报道结果类似。本研究结果显示，血清miR-451a相对表达水平在不同肿瘤最大径、分化程度、FIGO分期、淋巴结转移和CA125水平卵巢癌患者间比较，差异有统计学意义(P<0.01)，说明血清miR-451a相对表达水平是卵巢癌的预后指标。随访3年发现，卵巢癌生存组血清miR-451a相对表达水平明显高于死亡组，说明血清miR-451a相对表达水平与预后明显相关，当血清miR-451a相对表达水平≤1.43时，其预测3年内发生死亡的灵敏度为96.8%，特异度为73.4%，AUC为0.820，说明血清miR-451a相对表达水平在预测卵巢癌患者3年内发生死亡具有较高的效能。

本研究结果显示，卵巢癌患者血清miR-221-3p相对表达水平与miR-451a相对表达水平呈负相关，两者存在某种内在联系，miR-221-3p作为癌基因对癌细胞的生长具有促进作用，而miR-451a基因作为一种抑癌基因抑制肿瘤的生长，其具体机制需要进一步研究。本研究发现，联合检测miR-221-3p和miR-451a相对表达水平能够提高对卵巢癌患者3年内出现死亡的预测效能，其灵敏度高达87.1%，特异度为91.1%，其AUC明显高于miR-221-3p和miR-451a单项检测，说明两个指标之间存在某种互补性，能够提高预测卵巢癌患者3年内发生死亡的效能，为卵巢癌患者是否采取进一步干预措施提供理论依据，对卵巢癌患者术后适度治疗具有重要的临床指导意义。

总之，血清miR-221-3p和miR-451a相对表达水平在预测卵巢癌患者预后中具有重要的临床价值，联合检测能够明显提高预测效能。