乌鲁木齐市羊源沙门菌的污染调查

朱梦含，刘英玉，蒋金豆，卢 玮，夏利宁，衡昭君

(新疆农业大学 动物医学学院 自治区重点实验室“新疆草食动物新药研究与创制重点实验室”，新疆 乌鲁木齐 830052)

沙门菌(Salmonella)是一种常见的人兽共患病原菌，其抗原性复杂，血清型达2 600多种[1]，主要在人和动物的肠道内寄生，可以引起畜禽等动物的伤寒、副伤寒等疾病。由于沙门菌没有分解蛋白质的能力，所以感染食物时，通常不会引起食物变质，老年人和免疫力低下的人群摄入被沙门菌感染的食物后，沙门菌在宿主肠道内大繁殖，引起机体急性肠胃炎等肠道炎症，如果病原体侵入血液则会造成菌血症和败血症等全身性感染[2]。沙门菌对生存环境要求不高，室温下即可繁殖生长，在畜禽养殖场的地面、饲料、体表都有发现[3]。绵羊作为沙门菌的天然宿主，在饲养的过程有可能被其污染，被感染的绵羊不分年龄、性别和品种，流产率和病死率可达50%以上[4]。新疆作为我国五大牧区之一，绵羊养殖产业具有悠久的发展历史，日常生活中，羊肉消费量占家庭肉类消费总量的70%以上[5]。而绵羊屠宰、运输和售卖等过程都有可能携带沙门菌，当沙门菌通过食物进入人类肠道时，被感染的免疫力低下的人群症状会比较严重，从而引起并发症危害身体健康。近些年来抗生素也被广泛应用于绵羊养殖和疾病治疗，导致出现了大量的多重耐药菌株，更为严重的是多重耐药菌可能会通过食用动物产品传递给人类。据报道，细菌产生耐药性后，其毒力有所增强，且多重耐药的菌株也会比敏感菌株的毒力强[6-9]。目前关于新疆地区羊源沙门菌的监测报告较少，本研究对乌鲁木齐市周边地区的散养农户进行沙门菌的污染调查，检测菌株毒力基因的存在情况和耐药情况，为本地区绵羊养殖场中沙门菌的防控和公共卫生安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品2019年12月于乌鲁木齐市周边的5家绵羊养殖农户进行采集样品，合计258份，分别是粪便样品81份、肛拭子样品96份、饲草料样品15份、体表拭子样品69份。

1.2 菌株及培养基大肠埃希标准质控菌(ATCC25922)和鼠伤寒沙门菌(ATCC13311)购自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

缓冲蛋白胨水(BPW， HB4084)、氯化镁孔雀绿肉汤增菌液(RVS，HB4092)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基(XLD，HB4105)、营养肉汤(NB，HB0108)均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 主要试剂及设备2×Taq Master Mix、dd H2O、DL2000 DNA Marker购自于宝日医生物技术有限公司(TaKaRa)；核酸染料、TE缓冲液、琼脂糖购自于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

13种抗生药物标准品：环丙沙星(ciprofloxacin，CIP，含量100.00%)，恩诺沙星(enrofloxacin，ENR，含量100.00%)，阿莫西林-克拉维酸钾(amoxicillin and clavulanate potassium，AMC，含量95.00%)，头孢噻呋(ceftiofur，CF，含量100.00%)，氨苄西林(ampicillin，AMP，含量86.50%)，头孢曲松钠(ceftriaxone sodium，CRO，含量97.00%)，头孢西丁钠(cefoxitin sodium，FOX，含量98.00%)，庆大霉素(ge-ntamicin，GEN，含量54.60%)，卡那霉素(kanamycin，KAN，含量77.40%)，四环素(tetracycline，TET，含量95.00%)，氯霉素(chloramphenicol，CHL，含量99.70%)，大环内酯类的阿奇霉素(azithromycin，AZM，98.00%)，多肽类的多黏菌素E(colistin，CL，68.68%)以上全部购自中国兽医药品监察所。

LDZX-50 KB立式压力蒸汽高压锅购自上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD博迅净化工作台购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP-9162恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；PL203电子天平购自梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司；DYCP-31 DN水平电泳槽和DYCP-31 DN稳压稳流电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；GELDOCXR+凝胶成像系统购自美国BIO-RAD公司。

1.4 方法

1.4.1沙门菌的分离培养与invA基因PCR鉴定 按照国家标准沙门菌检验方法GB 4789.4-2016[10]进行菌株的分离培养，采用PCR扩增invA保守基因鉴定沙门菌。通过煮沸法提取菌株DNA模板[11]，引物由西安擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列见表1。PCR扩增体系为25.0 μL：Master Mix10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 13.0 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，最后延伸10 min。取7.0 μL的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶程序系统进行判定。

1.4.2沙门菌的毒力基因检测 按参考文献[8,12-15]合成沙门菌的19种毒力基因的引物。毒力岛(SPI)、毒力质粒、鞭毛及肠毒素的基因序列、种、功能及退火温度见表1。PCR体系和具体反应程序运行条件及检测如1.4.1中所述。

表1 毒力基因引物序列和生物学功能

1.4.3沙门菌的药敏试验及其判定 参考CLSI标准方法[16]进行抗菌药物的配制，配制的抗菌药液先用质控大肠杆菌(ATCC25922)进行测定，测定合格后，再分装药液保存于-20℃备用。采用琼脂稀释法对分离的沙门菌进行8类13种抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)值测定，分离株的药敏结果根据CLSI标准进行判定，判定结果为敏感(S)、中介(I)和耐药(R) 3种标准。

1.4.4数据分析 数据采用Office 2019 Excel进行统计分析。

2 结果

2.1 检出分析从258份样品中共分离鉴定出62株沙门菌，总分离率为24.03%(62/258)，粪便、肛门拭子、饲料、体表拭子的分离率分别是12.82%(10/78)，30.21%(29/96)，13.33%(2/15)，30.43%(21/69)。整体上，肛门拭子和体表拭子的污染较高。如表2所示5家农户的分离率均达到20%以上(21.21%～26.67%)。随机挑选了20株来自不同农户，不同样品种类的沙门菌送诺禾致源生物信息科技有限公司进行全基因组框架测序[17]，根据基因组序列的预测结果显示16株为阿贡那沙门菌(S.Agona)，4株为赛罗沙门菌(S.Carro)。

表2 5家农户不同样品中沙门菌的分离鉴定

2.2 毒力基因检测分析对分离鉴定的62株沙门菌进行了19种毒力基因的检测，共检出16种毒力基因，携带毒力基因最少的是6种；携带毒力基因最多的是15种，有6株沙门菌。每一株沙门菌所携带的毒力基因谱如图1所示，大部分菌株携带毒力基因的范围在11～15种之间。有呈现相同的毒力基因谱型的菌株是来自不同的样品。

黑色方块代表毒力基因存在;白色方块代表毒力基因缺失

毒力基因的检出率如图2所示，62株沙门菌都携带SPI-1上的invA(100.00%)、sipB(100.00%)，SPI-2上的ssaQ(100.00%)基因，其次是SPI-1上的invJ(98.39%)、mogA(87.10%)，SPI-2上的spiA(98.39%)、sifA(87.10%)、sseL(66.13%)，SPI-3上的mgtC(80.65%)，SPI-5上的araB(98.39%)、sopB(93.55%)，和跟肠毒素相关的stn(96.77%)以及位于菌毛上的lpfC(87.10%)、bcf(66.13%)的检出率较高；检出率较低的毒力基因依次是毒力质粒上的spvA(16.13%)和spvR(16.13%)基因。未检出spvB、spvC、spvD基因。

2.3 沙门菌的耐药情况检测62株沙门菌对13种抗生素的耐药性结果如图3所示，耐药率超过40%以上的有10种，分别是AMC(93.5%)、TET(93.5%)、AMP(91.9%)、CF(80.6%)、CL(79.0%)、CRO(69.4%)、FOX(66.1%)、KAN(64.5%)、GEN(59.7%)、ENR(40.3%)。耐药率较低的有2种CHL(1.6%)和AZM(1.6%)。

图3 62株沙门菌对13种抗生素的耐药率

多药耐药的结果如图4所示，至少对2种及以上的抗生素产生耐药，分布在2～10耐之间，从高到低的多重耐药率依次是8耐(23.3%)、9耐(21.7%)、10耐(16.7%)、5耐(11.7%)、6耐(11.7%)、7耐(8.3%)、3耐(5.0%)、4耐(3.3%)。其中耐8种抗菌药物的有14株菌株。

图4 62株沙门菌的多重耐药结果

62株沙门菌的耐药谱型如图2所示，共有38种耐药谱。其中ENR+KAN+CF+FOX+GEN+AMC+CRO+TET+AMP+CL为优势耐药谱，共有9株沙门菌，其次为KAN+CF+FOX+GEN+ AMC+CRO+TET+AMP+CL和KAN+CF+GEN+AMC+CRO+TET+AMP+CL，分别有7和6株沙门菌。

图2 62株沙门菌的毒力基因检出率

3 讨论

沙门菌是一种常见的食源性病原体，在世界范围内广泛传播。本试验从乌鲁木齐市周边5个绵羊养殖农户中采集的4类样品共285份，检出沙门菌62份，总检出率为23.8%。每户阳性率均超过了20.0%，其中粪便、肛拭子、饲料、体表拭子的检出率依次为12.8%，30.2%，13.3%，30.4%，在检测的4类样品中，肛门拭子和体表拭子的检出率较高，粪便和饲料的检出率较低，说明沙门菌在绵羊的饲养条件下普遍存在。来自饲料的沙门菌检出率比何继军等[18]和韩志辉[19]的分离率略低，高于陈沁等[20]在进口动物饲料中沙门菌的分离率，与YANG等[21]在文献中关于绵羊样本的监测结果接近一致。饲料中沙门菌的检出率较高，可能是由于养殖户出于经济成本的考虑在饲料中添加一些剩菜叶，干草和冻萝卜等农作物来中和全价饲料，建议加强养殖户关于保存饲料的洁净程度对于养殖重要性的理念。饲料安全不但关系到被饲喂动物的安全和生产效率，也间接影响人类的健康和生命安全。不同研究中沙门菌污染流行率的差异可能与饲养管理不当和环境消杀工作没有做好以及养殖物种的不同有关。本研究随机挑选20株沙门菌菌种鉴定结果显示，16株为阿贡那沙门菌，4株为赛罗沙门菌，阿贡那沙门菌为优势血清型。绵羊可以感染多个血清型，除鼠伤寒沙门菌、羊流产沙门菌和都柏林沙门菌外，很少有其他血清型能引起临床发病[22]，但这些对绵羊非致病性的血清型可造成绵羊产品的感染，在公共卫生学上具有重要意义。

毒力基因检测中存在非常多的毒力岛(SPI)上的基因SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-5，和较多的鞭毛上的基因及跟肠毒素有关的基因，存在较少的毒力质粒上的基因，与LI等[14]、孙璐等[15]和SKYBER等[23]从健康禽类中分离的沙门菌编码的毒力基因检测结果相近。本次检测发现所分离的沙门菌具有高水平的毒力岛基因，但是并未检出spvB、spvC、spvD毒力质粒基因，分析可能是这3种毒力质粒只存在于特定的血清型[24]，所以没有在此次调查中被检出。抗菌药在生产实践中被广泛使用，耐药性的问题日益突出，成为世界性难题，为了解我国各地沙门菌耐药性蔓延情况，各学者都对当地沙门菌的耐药性进行了监测和研究[25-26]。本研究结果表明62株沙门菌对抗菌药物具有较高的耐药性，耐药谱存在多样性，且有14株菌都表现出8重耐药，多重耐药现象严重，主要对四环素、阿莫西林克拉维酸、氨苄西林、多黏菌素以及头孢噻呋具有耐药性。相关报道[27-28]沙门菌对氨苄西林、氯霉素、卡那霉素、链霉素、磺酰胺、四环素和喹诺酮类药物具有高度抗性。分析发现沙门菌毒力基因的携带率与耐药性均较高，急需限制绵羊养殖业中抗生素的使用，对于维持良好的公共卫生安全具有较好的指导作用。