一次性腹腔注射环磷酰胺致卵巢储备功能下降模型大鼠意外死亡的病理分析

林光耀，张米佳，叶涛 ，邓莉，王茂霞2，王永周

(1. 西南医科大学附属中医医院妇科，四川 泸州 646000；2. 西南医科大学附属中医医院病理科，四川 泸州 646000)

卵巢储备功能下降(diminished ovarian reserve，DOR)是女性生育能力降低和月经稀发的重要原因，并以卵泡刺激素水平(follicle stimulating hormone，FSH)升高和抗苗勒管激素水平(anti-Müllerian hormone，AMH)下降为特征，也是早发性卵巢功能不全和卵巢早衰的初始阶段[1-3]。因此，越来越多的研究更积极于探索此病的发病机制以及治疗药物的作用靶点，故使用DOR模型大鼠成为目前实验研究的主要方法，其中使用一次性腹腔注射环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)诱导DOR模型大鼠法成为应用较为广泛的方式[4-6]。然而，使用CTX所引起的不良反应包括骨髓抑制(全血细胞减少)、胃肠道反应(腹泻和便秘等)和泌尿系统反应(尿血和出血性膀胱炎等)、生殖系统反应(卵巢早衰和精子减少症等)，且与药物剂量和用药时间呈相关性。但对于一次性腹腔注射CTX诱导DOR模型大鼠的剂量尚无统一标准，国内外研究所常用的剂量有90 mg/kg[4]和75 mg/kg[7]，尽管诸多研究对造模所使用的CTX不同剂量进行了比较[8-9]，但鲜有文献对造模过程中药物对意外死亡大鼠的影响进行分析。故笔者通过对实验过程中大鼠以90 mg/kg剂量一次性腹腔注射CTX后至药物灌胃前期间意外死亡大鼠进行大体解剖并对心、肺、肾、肝和胃行HE染色观察，以探究药物可能对大鼠意外死亡的影响，从而提高DOR模型大鼠存活率，为将来研究减少甚至避免大鼠意外死亡提供理论依据。

1 材料和方法

1.1实验动物 清洁级10～12周龄SD雌性未孕大鼠60只，购于西南医科大学动物实验中心(城北校区)，动物许可证号：SCXK(川)2018-17，体重(247±14) g，饲养室温度23～25 ℃，每笼饲养箱饲养5只大鼠，所有大鼠均自由饮水及摄食大鼠维持饲料，12 h昼夜交替，每2～3天更换垫料1次。适应性喂养1周，观察大鼠一般情况，包括：体质量、小便颜色、大便质地、精神状态、皮毛疏密程度等；随后两周行阴道脱落细胞学检查，筛选动情周期正常的大鼠纳入本实验。

1.2实验主要试剂 注射用CTX(江苏盛迪医药有限公司)规格：0.2克/支，保存于4 ℃冰箱，购自西南医科大学附属中医医院；黏附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司)；定性滤纸、瑞氏-姬姆萨复合染液(北京索莱宝科技有限公司)；苏木素-伊红染色试剂盒(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)；4%多聚甲醛溶液(Biosharp生物科技)；二甲苯(中国山东莱阳铁塔化工制品厂)。

1.3实验分组及造模 选取清洁级10～12周龄SD雌性未孕大鼠60只，适应性喂养一周后，连续两周定时行阴道脱落学细胞检查。使用20 μl移液器吸取0.9%氯化钠溶液，缓慢插入大鼠阴道内约0.2～0.4 cm，反复抽吸2～3遍，将移液器枪头中含有脱落细胞的液体均匀转移至载玻片上，按照瑞氏-姬姆萨复合染液说明书操作进行细胞染色观察，大鼠正常动情周期包括动情前期：大量有核上皮细胞；动情期：大量无核角化细胞；动情后期：大量无核角化细胞混杂少量有核上皮细胞；动情间期：白细胞占优势，偶见少量有核上皮细胞(见图 1)。将有正常动情周期大鼠随机分为空白组对照组10只和造模组50只。参照一次性腹腔注射CTX 90 mg/kg诱导DOR模型法[4，10]，造模前所有大鼠均禁食禁饮12 h，用10 ml 0.9%氯化钠溶液配制0.2 g CTX，将配制好的溶液置于4 ℃冰箱保存并于2 h内注射完毕，腹腔注射部位均选择大鼠左侧下腹部，同时将大鼠处于头低位，针头与腹壁呈40°～50°角之间，避免刺伤膀胱及腹腔脏器，针头刺入腹腔约0.5 cm后回抽，确保针头进入腹腔，缓慢推注药物，用拇指顺时针轻柔大鼠腹部10 s促使药物分布。空白组大鼠注射同剂量生理盐水。以上操作均由同一实验人员和助手进行。

A：动情前期；B：动情期；C：动情后期；D：动情间期。

1.4病理学观察 造模组大鼠腹腔注射CTX后均按前期方式正常饲养，每天定时观察各组大鼠一般情况并详细记录，当发现意外死亡大鼠后立即于无菌操作台上解剖，先观察大鼠内脏的一般大体形态，随后摘取双肺、心脏、肝脏、胃和双侧肾脏组织，去除多余脂肪组织后用PBS溶液(pH值7.2)洗去多余血渍，放入盛有4%多聚甲醛溶液的EP管中固定，并于4 ℃冰箱保存，组织与多聚甲醛溶液比例为1∶10，石蜡包埋所取组织、切片、HE染色、光镜下观察各组织病理学变化。

2 结果

2.1各组大鼠一般情况观察 与对照组相比，造模组大鼠精神萎靡，活动量减少，进食减少，体质量逐渐下降。造模后第2周体重与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.001)。见表1。

2.2病理学结果

2.2.1大鼠胃组织病理学结果 肉眼观察造模组大鼠胃组织均出现胃体积气，未见胃内容物；肉眼观察对照组大鼠胃组织形态正常，可见胃内容物；两组标本均未见胃穿孔及溃疡表现。通过对两组大鼠胃组织进行病理形态学观察发现，与对照组相比，造模组大鼠胃浅表黏膜糜烂，浅表上皮细胞脱落(见图2)。

表1 各组大鼠一般情况比较

2.2.2大鼠肺组织病理学结果 肉眼观察造模组大鼠肺组织呈深红色或暗红色，多数大鼠肺组织有明显的肺水肿改变，并且有2例大鼠出现胸腔积液表现；肉眼观察对照组大鼠肺组织呈粉红色，均未见胸腔积液表现。通过对两组大鼠肺组织进行病理形态学观察发现，与对照组相比，造模组大鼠肺组织呈广泛淤血，肺泡间隔增宽，肺上皮细胞水肿改变(见图3)。

2.2.3大鼠心脏、肝脏和双侧肾脏组织病理学结果 分别通过肉眼及病理形态学对比观察两组大鼠心脏、肝脏和双侧肾脏组织均未见明显异常。

1A和2A分别为造模组和对照组肉眼观；1B和2B分别为造模组和对照

3A和4A分别为造模组和对照组肉眼观；3B和4B分别为造模组和对照

3 讨论

对DOR模型大鼠的建立方法主要包括腹腔注射CTX[4]、灌胃雷公藤多甙[11]、腹腔注射去氧乙烯基环己烯和顺铂[12-13]、重复制动应激[14]、慢性应激[15]、γ射线照射[16]等。其中使用一次性腹腔注射CTX能对正常卵巢结构和功能产生影响，加速卵巢颗粒细胞凋亡，诱导卵泡的质量和数量发生改变，其特点与人类DOR表现相似，且兼有操作简单、成本低和可重复性稳定等优点，故目前研究常利用此法诱导DOR模型大鼠[17-18]。虽然CTX对卵巢的毒性作用机制尚未被完全阐释，但目前已被证实的主要途径包括：①CTX被CYP2B和CYP3A激活生成4-羟基环磷酰胺(4-OH-CPA)，随后转化为醛磷酰胺，醛磷酰胺又被代谢为磷酰胺氮芥，通过DNA损伤诱导凋亡途径，快速破坏增殖细胞[19]；②CTX通过激活PI3K/PTEN/AKT信号通路使卵母细胞中FOXO3a磷酸化增加，进一步与卵巢Puma启动子中的位点结合，并以不依赖p53的方式激活其表达，也可诱导DNAPK-γH2AX-CHK2-p53/TAp63α信号轴激活，最终促使卵母细胞凋亡[20-21]；③CTX药理作用具有非细胞周期特异性，一方面能破坏静止期细胞，使其迅速裂解，另一方面也可加速卵巢内原始卵泡耗竭，表现出卵巢分泌的卵泡刺激素和黄体生成素水平升高，雌二醇水平降低[22-23]。

CTX对卵巢的毒性影响并不是“有或无”效应，而是与药物剂量呈相关性。Maman E等[24]通过对38只成年雌性小鼠分别一次性腹腔注射CTX 100 mg/kg(8只)、50 mg/kg(12只)和0 mg/kg(18只)，观察小鼠卵巢内原始卵泡数量(primordial follicles ，PMF)发现未注射CTX组大鼠PMF为(469±24)个，注射100 mg/kg和50 mg/kg组大鼠PMF分别为(234±19)个和(307±27)个，明显少于未注射CTX组，且药物剂量越大PMF越少(P<0.0001)。Wang ZY等[25]研究使用CTX 50 mg/kg剂量，每隔1 d，连续8 d腹腔注射后发现大鼠肠黏膜派氏结(PPs)计数、CD19+细胞比例、脾脏和胸腺指数、体质量和肠道黏膜sIgA、IFN-γ、IL-4和IFN-γ/IL-4比值降低，CD3+细胞比例升高(P<0.05)，大鼠出现腹泻和大便干燥现象。另外，腹腔注射CTX可直接损伤实验小鼠肝脏和凝血功能，表现出凝血酶原时间、凝血酶时间和活化部分凝血活酶时间延长，血浆纤维蛋白原增多，淋巴细胞、血小板、白细胞和中性粒细胞减低；其中，对电解质的影响以钾离子降低和氯离子升高为主，且与药物剂量和用药时间关系紧密[26-29]。由此推断：①CTX对大鼠免疫功能的抑制使机体抗病能力降低，更易受外界病原体侵袭出现机会性感染；②CTX所致凝血功能异常可能是我们实验中大鼠出现尿血、眼眶和鼻腔出血的重要原因；③CTX对胃肠道细胞因子和血清电解质的影响均可能导致大鼠进食减少、体重降低甚至出现腹泻或大便干燥等异常；反之，注射CTX后大鼠出现腹泻和摄食减少亦可加重电解质紊乱，使大鼠出现精神萎靡，活动量减少等表现，恰与本实验大鼠表现一致。

本实验通过对雌性SD大鼠一次性腹腔注射CTX(剂量为90 mg/kg)发现大鼠出现不良反应较多，死亡率较高，造模后第一周死亡率为8%(4/50)，略低于文献报道的12%(6/50)[30]，但于灌胃前总死亡率为24%(12/50)，通过检查腹腔注射部位，未见红肿、渗血及渗液等感染迹象。为减少由腹腔注射CTX所引起的不良反应，降低大鼠死亡率，Wang XH等[31]研究发现，CTX腹腔注射前予以桦木酸预处理可降低小鼠肠道中丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量，抑制超氧化物歧化酶(SOD)活性；并且桦木酸可显著下调小鼠血清促炎细胞因子IL-5、IL-17、IL-12和TNF-α水平，通过增强ZO-1和Claudin-1mRNA表达，以改善由CTX破坏的胃肠道物理和免疫屏障，增强抗炎和抗氧化效果。此外，维生素E作为天然的抗氧化剂可通过降低IL-1β和TNF-αmRNA水平，改善CTX对大鼠肝脏产生的氧化应激损伤和炎性反应，促进氧化应激标志物(SOD、GPX、CAT和MDA)和肝功能标志物(ALT、AST、ALP)恢复正常[32-33]。

然而，本研究尚存以下不足：①大鼠死亡后易出现溶血现象，无法通过血液检测方法评估大鼠肝肾功能、电解质及免疫功能状况，使重要脏器的病理形态学结果作为证据较单一且缺乏特异性；②对照组大鼠和造模组大鼠数量差异较大，不排除由于对照组大鼠样本量小而出现统计学结果偏倚，尚需大样本实验研究支持；③本实验大鼠死亡时间有差异，不排除注射CTX后因大鼠个体差异对药物产生的副作用表现不明显或趋于自愈情况，造成本实验所观察结果不能反映所有大鼠的真实状况；④未使用代谢笼单独饲养大鼠，无法准确评估每只大鼠摄食和饮水量变化，也无法获取其代谢情况，使支持本实验结果的数据不够丰富；⑤未对照注射不同剂量或于不同时间注射CTX对意外死亡大鼠的影响，也没有对照同一剂量对不同周龄或不同品系和级别大鼠的影响；⑥我们后续实验改用75 mg/kg剂量造模，发现大鼠出现的不良反应及死亡率明显下降，但由于缺乏同期对照研究，故无法说明不同CTX注射剂量对本实验大鼠意外死亡产生影响。

4 结论

通过病理HE染色观察意外死亡大鼠重要脏器，发现大鼠肺组织充血、水肿明显；胃组织浅表黏膜糜烂。尽管以上因素可能不是大鼠致死的直接原因，但不排除上述病变分别是本实验大鼠出现异常呼吸，进食减少和体重降低的重要原因。因此，为使本实验更具科学性，后期可将一次性腹腔注射CTX诱导DOR模型法中大鼠死亡原因为实验思路，进行深入的相关课题研究，并将血液检测结合病理学结果进行分析大鼠意外死亡原因，提前干预由腹腔注射CTX所诱发的一系列“脱靶效应”，对比是否采取相应干预措施后能降低或避免由药物所致的大鼠死亡，为提高造模大鼠生存质量，降低不良反应及死亡率极具重要的现实意义。