复方芪苓颗粒“一测多药”薄层鉴别方法研究

颜继忠1，陈 忆1，应旭辉，姜慧洁1，黄 薇1，张 慧1，刘 雳

(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014；2.正大青春宝药业有限公司，浙江 杭州 310023)

复方芪苓颗粒(Fufang Qiling granules, FQG)是杭州中医院临床经验方，由黄芪、丹参、土茯苓、秦艽、薏苡仁、桑寄生以及山慈菇组方而成，疗效显著，具有健脾益气、化瘀泄浊和清热利湿的功能，临床上可用于治疗高尿酸血症，具有降低患者的血尿酸和血脂的作用[1-3]。西医治疗高尿酸血症主要使用别嘌醇、秋水仙碱和苯溴马隆等[4-5]，上述药物均存在损伤肝肾的不良反应，临床应用受到诸多限制[6-7]。中医药治疗高尿酸血症具有明显的优势，多种中药具有明显降低尿酸的功效[8-10]，且中药复方制剂具有增效减毒的优势，不良反应较少。复方制剂一般成分复杂，药材的质量优劣直接影响复方制剂的疗效。如何快速鉴别复方制剂中药材的质量，对提升产品质量至关重要。

目前，医院制剂的开发是中药发展的一个大方向，但是医院制剂的质量标准中薄层鉴别方法往往比较单一，未依据“君臣佐使”指导原则对多味关键药材进行定性，仅针对单味药进行单独鉴别，即每种药材都要单独优化其供试品制备方法、薄层展开剂和展开条件等，费时、费力、费试剂，且检测周期长，给质检部门带来极大的工作量。因此，寻找一种简便、快捷的中药复方制剂检测方法，以提高检测效率并降低检测成本，是中药质量控制必须突破的难关[11-12]。2020年5月试行的《中药新药质量标准研究技术指导原则(试行)》建议尽可能多地定性、定量检测处方中的药味，包括建立中药的含量测定方法[13-14]、中药指纹图谱方法[15-17]以及鼓励建立同时鉴别多个药味的薄层色谱方法。为了提高中成药的质量标准，更好地控制其质量，遵循“君臣佐使”指导原则建立“一测多药”的鉴别方法，即可在同一薄层色谱条件下鉴别处方中的丹参(君药)、土茯苓(臣药)和秦艽(臣药)3味药材。该方法操作简单快速、专属性强以及耐用性好，进一步完善了复方芪苓颗粒的质量标准，为新药开发并申请临床前研究批件提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪 器

SQP型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司，精度为十万分之一)，FA2204N型电子天平(上海菁海仪器有限公司，精度为万分之一)，KQ-250DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，R210+V700型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)，WD-9403A型紫外光灯(北京六一生物科技有限公司)。

1.1.2 试 剂

丹酚酸B对照品(批号为PS000278)，落新妇苷对照品(批号为PS000649)，龙胆苦苷对照品(批号为PS010119)，黄芪甲苷对照品(批号为PS010427)，甘油三油酸酯对照品(批号为PS012239)，槲皮素对照品(批号为PS010462)均购自成都普思生物科技有限公司；复方芪苓颗粒(批号为21001，21002，21003)。HSGF254型薄层色谱硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司，批号为20190912)，HSGF254型薄层色谱硅胶预制板(德国默克集团，批号为HX98648854)，HSGF254型薄层色谱硅胶板(青岛海洋硅胶有限公司，批号为20190912)，HSG型薄层色谱硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司，批号为20200515)，HSG型薄层色谱硅胶板(青岛海洋硅胶有限公司，批号为20200901)，HSG型薄层色谱硅胶板(德国默克集团，批号为HX90656126)。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的制备

取复方芪苓颗粒0.5 g，加入甲醇5 mL，超声处理30 min，取上清液，作为供试品溶液。

1.2.2 阴性对照溶液的配制

取缺丹参、缺土茯苓和缺秦艽的阴性颗粒，按照供试品制备方法制成阴性对照溶液。

1.2.3 对照品溶液的配制

取丹酚酸B、龙胆苦苷和落新妇苷对照品，加甲醇分别制成每1 mL含1 mg丹酚酸B、1 mg龙胆苦苷和1.5 mg落新妇苷的混合溶液，作为对照品溶液。

1.2.4 “一测多药”鉴别方法

吸取供试品溶液、对照品溶液以及阴性对照溶液各4 μL，点样于同一块硅胶GF254板上，以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(无水甲酸)=2∶7∶1∶0.5为展开体系进行展开，取出并晾干，在254 nm紫外光灯下进行检视。

2 结果与分析

2.1 “一测多药”展开体系的优化

2.1.1 不同展开体系的考察

参考文献[18-19]及2020版《中国药典》中丹参(三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸)、土茯苓(甲苯-乙酸乙酯-甲酸)和秦艽(乙酸乙酯-甲醇-水)鉴别项下所使用的展开溶剂，对“一测多药”的展开体系进行优化。取供试品溶液点样于硅胶GF254薄层板上，选取3种展开剂体系进行展开，分别为展开剂1(石油醚-乙酸乙酯-甲醇-无水甲酸)、展开剂2(石油醚-乙酸乙酯-甲苯-无水甲酸)和展开剂3(石油醚-乙酸乙酯-三氯甲烷-无水甲酸)。展开体系如图1所示，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-无水甲酸展开体系相较于其他2个展开体系，其斑点分离度与清晰度都较优，且其中的溶剂相较于三氯甲烷、甲苯毒性小。所以选择石油醚-乙酸乙酯-甲醇-无水甲酸展开体系继续进行溶剂比例考察。

图1 展开体系的考察Fig.1 Expanded system investigation

2.1.2 展开体系比例的考察

对上述优选的展开体系比例进行考察，结果如图2所示。取供试品溶液点样于硅胶GF254薄层板上，选取3种不同体积比的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-无水甲酸进行展开，分别为比例1(体积比为2∶7∶1∶1)，比例2(体积比为2∶7∶1∶0.5)，比例3(体积比为2∶7∶1∶0.3)。如图2所示，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(无水甲酸)=2∶7∶1∶0.5展开体系最优，可以达到快速鉴别复方芪苓颗粒中3味药的目的。

图2 展开体系比例的考察Fig.2 Proportion of expanded system investigation

2.2 “一测多药”方法学考察

2.2.1 专属性考察

分别取1.2.2节所述阴性对照溶液，按照供试品点样量点样于同一硅胶GF254板上，色谱图如图3所示。结果表明：丹酚酸B、落新妇苷和龙胆苦苷所出现的位置在供试品色谱中均能与之相对应，且阴性对照色谱中均未出现干扰的斑点，说明该方法的专属性较强。

1，2，3—芪苓颗粒供试品溶液(批号分别为21001，21002，21003)；4—混合对照品溶液；5—缺丹参阴性对照溶液；6—缺土茯苓阴性对照溶液；7—缺秦艽阴性对照溶液。图3 薄层专属性色谱图Fig.3 TLC chromatogram of specificity

2.2.2 点样方式与点样量考察

考察不同点样方式(点状点样、条状点样)与点样量(2，4，8，10 μL)对薄层色谱行为的影响，色谱图如图4所示。上述因素对复方芪苓颗粒的薄层色谱行为影响较小。结果表明：两种点样方式与不同点样量均有较好的分离效果，点状点样与条状点样均可用于复方芪苓颗粒的薄层鉴别，供试品点样量可以控制在2～10 μL。

1，2，3—点样量为2 μL；4，5，6—点样量为4 μL；7，8，9—点样量为8 μL；10，11，12—点样量为10 μL(芪苓颗粒供试品批号依次为21001，21002，21003)；13—混合对照品溶液；14—缺丹参阴性对照溶液；15—缺土茯苓阴性对照溶液；16—缺秦艽阴性对照溶液。图4 不同点样方式及点样量的薄层色谱图Fig.4 TLC chromatogram of different spotting methods and volumes

2.2.3 耐用性考察

考察不同厂家的高效硅胶板(Merck板，青岛海洋板，烟台江友板)、不同展开温度((10±5)，(40±5) ℃)和不同相对湿度((20±2)%，(80±2)%)对薄层色谱行为的影响，色谱图如图5，6所示。结果表明：上述因素对复方芪苓颗粒的薄层色谱行为影响较小；不同厂家的薄层板均具有较好的分离效果，表明该鉴别对薄层板并没有特殊选择；环境温度及湿度的变化对分离效果也无较大影响，温度为10～40 ℃，湿度为20%～80%均可，无需进行严格控制。

1，2，3—芪苓颗粒供试品溶液(批号依次为21001，21002，21003)；4—混合对照品溶液；5—缺丹参阴性对照溶液；6—缺土茯苓阴性对照溶液；7—缺秦艽阴性对照溶液。图5 不同厂家薄层板的耐用性薄层色谱图Fig.5 TLC chromatogramof durability from different manufacturers

1，2，3—芪苓颗粒供试品溶液(批号依次为21001，21002，21003)；4—混合对照品溶液；5—缺丹参阴性对照溶液；6—缺土茯苓阴性对照溶液；7—缺秦艽阴性对照溶液。图6 不同温湿度耐用性薄层色谱图Fig.6 TLC chromatogram of durability at different temperatures and humidities

3 结 论

以“君臣佐使”理论为指导，提出了“一测多药”的薄层鉴别思路，即通过一次薄层实验，对中药复方制剂中的多味药材进行同步鉴别。以复方芪苓颗粒为例，“一测多药”法可对颗粒中丹参(君药)、土茯苓(臣药)和秦艽(臣药)3 味药材进行同步鉴别，且阴性颗粒对照无干扰。此外，相较于《中国药典》中丹参(三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸)、土茯苓(甲苯-乙酸乙酯-甲酸)鉴别方法中使用的三氯甲烷、甲苯，该方法中所使用的石油醚、乙酸乙酯、甲醇和无水甲酸均为毒性较小的溶剂。综上所述，复方芪苓颗粒的“一测多药”的薄层鉴别方法仅需1种供试品制备方法和1种展开体系即可快速鉴别复方制剂中的多味药，有效节约溶剂及人工成本，可为中药复方制剂的质量评价提供参考。

本文得到了浙江工业大学研究生实践基地建设项目(GZ19621160006)的资助。